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.2015年11月；84(8):1411-22.
doi:10.1016/j.theriogenology.2015.07.028。 Epub 2015年7月29日。

组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶SETDB1是牛胚泡发育所必需的

迈克尔·C·戈尔丁 1, 马修·斯奈德 2, 盖尔·L·威廉姆森 2, 凯莉·J·威西 2, Michael Peoples公司 2, 简·H·普赖尔 2, 马克·韦斯特胡辛 2, 查尔斯·R·朗 2
附属公司

牛胚泡发育需要组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶SETDB1

迈克尔·C·戈尔丁等。 病因学. 2015年11月.

摘要

来自转座因子选择分支的转录物是最早出现在早期小鼠和人类胚胎中的转录物之一，表明转座因子及其活性调节机制是建立哺乳动物谱系的基础。然而，这些寄生序列参与指导发育程序的机制尚不明确。转座元件通过表观遗传方式进行调控，其中DNA甲基化和组蛋白3赖氨酸9三甲基化（H3K9me3）的组合模式抑制其转录。在啮齿类动物的研究中，SET域分叉1（SETDB1）已成为核心甲基转移酶，负责标记H3K9me3转座元件并暂时调节其转录活性。在小鼠中进行的SETDB1功能丧失研究表明，尽管胚胎外组织不需要这种甲基转移酶，但如果没有甲基转移酶的话，胚胎本身的建立就会失败。由于牛胚胎在植入前阶段的早期就启动了表观遗传编程过程，我们试图确定抑制SETDB1是否会阻止内细胞团的形成。我们在此报告，牛SETDB1转录物在植入前发育过程中存在，基于RNA干扰的缺失会阻止桑椹胚发育阶段的胚胎生长。虽然我们没有观察到全球组蛋白甲基化或转座元件转录的改变，但我们确实观察到H3K27乙酰化的全球水平增加，这是一种与活性增强子相关的表观遗传标记。我们的观察表明，SETDB1可能与控制增强子功能的表观遗传机制相互作用，抑制这种甲基转移酶可能会破坏牛的发育程序。

关键词：发展计划；增强剂；表生；甲基转移酶；SETDB1。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
牛设置DB1牛植入前胚胎的表达和siRNA介导的缺失。A） 编码牛的转录物的测量设置DB1在胚胎发生期间。的级别设置数据库1用q-RT-PCR检测牛卵母细胞和植入前发育不同阶段的mRNA。B） siRNAs靶向验证设置数据库1采用瞬时转染牛胎儿成纤维细胞。设置DB1使用q-RT-PCR对转录物水平进行定量。C–D）测量设置DB1使用q-RT-PCR从对照组、siNull和siSETDB1处理组获得的牛8细胞（C）和桑椹胚（D）的转录物。对于A–D，样本归一化为GAPDH、YWHAZ和SDHA的几何平均值，并使用2-ΔΔCT方法[52]。图是四个独立实验的代表。误差条代表SEM，***表示p<0.001和****p<0.0001。E–G）si的发育性抑制设置DB1处理过的胚胎。扩张囊胚期非注射对照组（E）和siNull胚胎（F）的共聚焦图像，以及停滞桑椹胚期设置DB1注射胚胎（G）。右侧显示注射的绿色荧光右旋糖酐染料的20x图像，左侧显示明亮的视野图像。
图2
图2
si中翻译后组蛋白修饰的分析设置DB1注射胚胎。活的桑椹期胚胎的代表性共焦图像与（A）H3K4me3（绿色）/H3K9me2（红色）/Hoechst（蓝色）以及（B）H3K9me3（蓝色）/H3G27（红色）/Hoechs特（蓝色）共同染色。图像放大20倍。C） 通过将特定靶点（H3K4me3、H3K9me2、H3K9me3和H3K27me3）的强度除以DNA染色强度（Hoechst），计算每个胚胎的平均荧光强度比。然后对每个胚胎的每个翻译后修饰比率进行平均，以获得每个治疗组和染色组合的平均比率。使用这些方法，构建了一个单向方差分析模型，以确定各染色处理组之间的差异。显示不同字母的条形图被认为存在显著差异(第页< 0.05). 误差条代表SEM。
图3
图3
si中5-甲基胞嘧啶和5-羟基-甲基胞嘧啶的全球水平分析设置DB1注射胚胎。A） 桑椹胚期胚胎的代表性共聚焦图像与识别5-羟基-甲基胞嘧啶（绿色）/5-甲基胞嘧啶（红色）/DNA染色剂Hoechst（蓝色）的抗体共同染色。图像放大20倍。B） 通过将特定靶点（5-hMC或5-MC）的强度除以DNA染色强度（Hoechst），计算每个胚胎的平均荧光强度比。然后对每个胚胎的比率进行平均，以获得每个治疗组的平均比率。使用这些方法，建立了一个单向方差分析模型，以检查治疗组之间的差异。显示不同字母的条被认为是不同的(第页< 0.05). 误差条代表SEM。
图4
图4
硅中转座元素活性的分析设置DB1注射胚胎。A） 使用q-RT-PCR在牛囊胚中测量来自牛转座元件指示分支的转录物。B） 使用q-RT-PCR测量牛胎儿成纤维细胞中牛转座因子指示分支的转录物。C–D）对牛8细胞（C）和桑椹胚（D）中牛LINE1转录物的测量设置DB1治疗组采用q-RT-PCR。对于A–D，样本归一化为GAPDH、YWHAZ和SDHA的几何平均值，并使用2-ΔΔCT方法[52]。图是四个独立实验的代表。误差线代表SEM，*表示p<0.05。
图5
图5
硅中H3K27乙酰化的全球水平分析设置DB1注射的胚胎。A） 桑椹期胚胎的典型共焦图像与识别H3K27ac（绿色）和Hoechst DNA染色（蓝色）的抗体共同染色。图像放大20倍。B） 通过将H3K27ac的染色强度除以DNA染色的强度Hoechst来计算每个胚胎的平均荧光强度比。然后对每个胚胎的比率进行平均，以获得每个治疗组的平均比率。使用这些方法，构建了一个单向方差分析模型，以确定治疗组之间的差异。显示不同字母的条形图被认为是不同的(第页< 0.05). 使用事后Tukeys测试，siSetDB1组与Control组和siNull组之间的差异为（p<0.001）。误差条代表SEM。
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