Attenuated Human Parainfluenza Virus Type 1 (HPIV1) Expressing the Fusion Glycoprotein of Human Respiratory Syncytial Virus (RSV) as a Bivalent HPIV1/RSV Vaccine

doi:10.1128/JVI.01380-15

.2015年10月；89(20):10319-32.

doi:10.1128/JVI.01380-15。 Epub 2015年7月29日。

表达人呼吸道合胞病毒（RSV）融合糖蛋白的减毒人1型副流感病毒（HPIV1）作为HPIV1/RSV双价疫苗

娜塔莉·麦可夫¹, Emérito Amaro-Carambot公司¹, 伯亮（Bo Liang）¹, 索尼娅·苏尔曼¹, 马蒂亚斯·林格曼¹, 杨丽娟¹, 彼得·柯林斯¹, 希林·穆尼尔²

附属公司

¹美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏症和传染病研究所传染病实验室RNA病毒科。
²美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所传染病实验室RNA病毒科munirs@niaid.nih.gov。

PMID： 26223633
预防性维修识别码：项目经理4580189
DOI（操作界面）： 10.1128/JVI.01380-15

表达人呼吸道合胞病毒（RSV）融合糖蛋白的减毒人1型副流感病毒（HPIV1）作为HPIV1/RSV双价疫苗

娜塔莉·麦可夫等。 J维罗尔. 2015年10月.

.2015年10月；89(20):10319-32.

doi:10.1128/JVI.01380-15。 Epub 2015年7月29日。

作者

娜塔莉·麦可夫¹, Emérito Amaro-Carambot公司¹, 伯亮（Bo Liang）¹, 索尼娅·苏尔曼¹, 马蒂亚斯·林格曼¹, 杨丽娟¹, 彼得·柯林斯¹, 希林·穆尼尔²

附属公司

¹美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏症和传染病研究所传染病实验室RNA病毒科。
²美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所传染病实验室RNA病毒科munirs@niaid.nih.gov。

PMID： 26223633
预防性维修识别码：项目经理4580189
DOI（操作界面）： 10.1128/JVI.01380-15

摘要

研究了减毒重组人副流感病毒1型（rHPIV1）作为表达呼吸道合胞病毒（RSV）融合（F）糖蛋白的载体，以提供针对RSV和HPIV1的二价疫苗。RSV F基因被设计成包含HPIV1转录信号，并分别插入两个减毒rHPIV1主干中的三个基因位置。每个主干都包含一个之前描述过的稳定抗去衰减的衰减突变，特别是一个涉及重叠P/C开放阅读框（ORF）（C（Δ170））中6个核苷酸的非温度敏感性缺失突变或L ORF（L（Y942A））中的温度敏感性错义突变。基因组中的插入位点为前N（F1）、N-P（F2）或P-M（F3），并且两个主干都相同。在体外，F插入物的存在降低了病毒复制的速度，但最终滴度与野生型（wt）HPIV1的最终滴度相同。用rHPIV1-C（Δ170）-F1、-F2、-F3和rHPIV1-L（Y942A）-F1在培养细胞中观察到RSV F的高水平表达。在仓鼠中，rHPIV1-C（Δ170）-F1、-F2和-F3载体在鼻甲中中度受限，在肺部高度受限，在体内遗传稳定。在C（Δ170）载体中，F1病毒是对wt RSV攻击最具免疫原性和保护性的。rHPIV1-L（Y942A）载体在体内受到高度限制，没有检测到免疫原性或保护性，表明其过度衰减。C（Δ170）-F1结构体似乎具有适当的减毒作用和免疫原性，可作为二价鼻内儿童疫苗进一步开发。

重要性：目前还没有针对儿童呼吸道病原体RSV和HPIV的疫苗。我们正在开发用于病毒感染婴儿的减毒RSV和HPIV活疫苗。特别是RSV减毒活毒株，由于生长不良和物理不稳定，很难培育，但这些障碍可以通过使用疫苗载体来避免。我们描述了表达RSV F蛋白的减毒rHPIV1活载体的开发和临床前评估。两个不同的减毒rHPIV1主干分别从三个不同的基因位置表达RSV F。rHPIV1-C（Δ170）-F1载体在P/C基因中具有衰减的缺失突变（C（△170）），并从前N位表达RSV F，在仓鼠模型中对RSV F蛋白和HPIV1具有减毒、稳定和免疫原性，并对RSV攻击提供了实质性保护。本研究提供了一种候选的rHPIV1-RSV-F疫苗病毒，适合作为对抗两种主要儿童病原体的二价疫苗继续开发。

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图1
构建包含插入第一（F1）、第二（F2）或第三（F3）基因位置的RSV F基因的HPIV1抗原cDNA。rHPIV1主干包含两种衰减突变之一：即C^Δ170或L^Y942A型P/C或L ORF分别发生突变（用*和●, 分别）。对于rHPIV1-F1构建物，将RSV F基因插入位于N基因上游非翻译区的MluI位点。对于rHPIV1-F2，RSV F基因插入rHPIV1 N和P基因之间，位于P基因上游非翻译区的AscI位点。对于rHPIV1-F3，将RSV F基因插入位于P基因下游非翻译区的NotI位点的rHPIV1 P和M基因之间。对于所有构建物，RSV F ORF是针对人类表达优化的密码子，包含两个HEK氨基酸分配（见正文）。每个RSV F插入物包含N基因末端（GE）、基因间（IG）和P基因起始（GS）序列，如图所示，因此RSV F的序列编码将被表达为一个独立的mRNA。

图2
病毒在Vero（A和C）和LLC-MK2（B和D）细胞中的多步骤复制。在0.01TCID的MOI下感染6孔板中的细胞单层的三硅酸盐孔₅₀带有rHPIV1-C^Δ170或-L^Y942A型表达RSV F基因（F1、F2或F3），带有rHPIV1-L^Y942A型或rHPIV1-C^Δ170空矢量，或使用wt HPIV1。培养物在32°C下培养。每隔24小时收集等分的细胞培养液，并测定病毒滴度（log₁₀TCID公司₅₀每毫升）通过LLC-MK2细胞的连续稀释和HAD测定。显示了SEM的平均滴度。使用Tukey多重比较后验的一元方差分析来确定每种病毒与wt HPIV1在p.i.第2天（指数复制时间）和第7天（达到最终滴度时）的滴度差异的统计显著性，用星号表示如下：*，*P（P）*≤ 0.05; **,*P（P）*≤ 0.01; ***,*P（P）*≤ 0.001; ****,*P（P）*< 0.0001.

图3
蛋白质印迹分析*在体外*通过rHPIV1-RSV-F载体表达RSV F和HPIV1蛋白。（A） Vero细胞在MOI为5 TCID时感染了指示的病毒₅₀在48 h p.i.时，用SDS样品缓冲液对细胞进行裂解。对所有样品进行变性、还原并进行SDS-PAGE。将蛋白质转移到PVDF膜上，并用RSV F特异性小鼠单克隆抗体或兔多克隆抗肽抗体检测HPIV1 N、P、HN或F蛋白。GAPDH被用作负荷控制。相应的红外染料结合抗鼠抗体和抗兔抗体被用作次级抗体。图像是使用奥德赛红外成像系统采集的。RSV F和rHPIV1载体蛋白分别呈红色和绿色。所示图像代表了三个独立的实验。（B和C）对三个独立的Western blot实验（其中一个实验如图A所示）中的蛋白带强度进行了量化，并显示其表达与相应F3病毒的表达相对应，其值为1.0。图表将数据显示为平均值±SEM。使用95%置信区间，通过Dunnett多重比较试验的单向方差分析，分析了指示病毒之间指示HPIV1蛋白表达差异的统计显著性，如下所示：*，*P（P）*< 0.05; **,*P（P）*< 0.01; ****,*P（P）*< 0.0001.

图4
仓鼠鼻甲（A）和肺（B）中rHPIV1-RSV-F载体的复制。仓鼠经静脉接种10只⁵TCID公司₅₀rHPIV1-C的^Δ170或-L^Y942A型表达RSV F基因（F1、F2或F3）、rHPIV1-L的载体^Y942A型或rHPIV1-C^Δ170空向量，wt HPIV1，rHPIV1-C^84G兰特C类^Δ170海南^553A型L（左）^Y942A型（HPIV1候选疫苗）或rB/HPIV3-F2（从第2位表达RSV F的牛/人嵌合PIV3）。在p.i.第3天和第5天处死动物（每天每种病毒6只动物），收集鼻甲和肺部并制备成组织匀浆。病毒滴度（log₁₀TCID公司₅₀每克组织）通过LLC-MK2细胞上的连续稀释和HAD测定来测定。显示了第3天（Δ）和第5天单个动物的称谓(●). 每组的平均值分别用水平虚线和实线表示第3天和第5天，第3天与第5天获得的值分别用粗体和斜体表示。检测限（LOD）为1.5 log₁₀TCID公司₅₀/ml，并用虚线表示。每种病毒与wt HPIV1或各自空载体之间的差异的统计显著性是通过使用95%置信区间的Tukey多重比较后验进行单向方差分析来确定的，并分别在下横线和上横线处表示，如下所示：*，*P（P）*≤0.05；***，*P（P）*≤ 0.001; ****,*P（P）*≤ 0.0001; ns，不显著(*P（P）*>0.05）。

图5
保护先前用rHPIV1-RSV-F载体免疫的仓鼠的鼻甲（A）和肺（B）免受挑战性wt RSV复制。仓鼠(n个=每组6个），用沿着x个axis（使用相同的动物评估免疫原性；表4），在p.i.30天时，用10⁶wt RSV A2的PFU。三天后，处死动物，收集鼻鼻甲和肺，制备组织匀浆，并测定挑战RSV的滴度（log₁₀每克组织的PFU）通过Vero细胞上的斑块试验测定。每组的平均值以粗体数字和水平条显示。病毒之间差异的统计显著性通过使用95%置信区间的Tukey多重比较后验进行单向方差分析确定，如下所示：*，*P（P）*< 0.05; **,*P（P）*< 0.01; ****,*P（P）*< 0.0001; ns，不显著(*P（P）*>0.05）。

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1. Nair H、Nokes DJ、Gessner BD、Dherani M、Madhi SA、Singleton RJ、O'Brien KL、Roca A、Wright PF、Bruce N、Chandran A、Theodoratou E、Sutanto A、Sedyaningsih ER、Ngama M、Munywoki PK、Kartasamta C、Simoes EA、Rudan I、Weber MW、Campbell H，2010年。幼儿呼吸道合胞病毒所致急性下呼吸道感染的全球负担：一项系统综述和荟萃分析。柳叶刀375:1545–1555。doi:10.1016/S0140-6736（10）60206-1。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
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1. Kim HW、Canchola JG、Brandt CD、Pyles G、Chanock RM、Jensen K、Parrott RH.1969年。尽管之前接种过抗原灭活疫苗，但婴儿仍患有呼吸道合胞病毒病。《美国流行病学杂志》89:422–434。-公共医学
1. Connors M、Collins PL、Firestone CY、Sotnikov AV、Waitze A、Davis AR、Hung PP、Chanock RM、Murphy BR，1992年。以前用嵌合RSV FG糖蛋白免疫的棉鼠，在感染RSV时，会出现增强的肺部病理学，这是用痘苗-RSV重组物或RSV免疫后不会出现的现象。疫苗10:475-484。doi:10.1016/0264-410X（92）90397-3。-内政部-公共医学

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