Therapeutic isolation and expansion of human skeletal muscle-derived stem cells for the use of muscle-nerve-blood vessel reconstitution

doi:10.3389/fphys.2015.00165

.2015年6月2日6:165。

doi:10.3389/fphys.2015.00165。 2015年电子收集。

人骨骼肌源性干细胞的治疗性分离和扩增用于肌-神经血管重建

田木哲郎¹, 内山义彦², Maki Hirata公司^三, 桥本博之², 中岛信义⁴, 斋藤小介⁴, 寺口敏郎⁵, Joji Mochida公司⁶

附属公司

¹日本东海大学医学院Isehara肌肉生理学和细胞生物学研究室；日本东海大学医学院Isehara人体结构与功能系。
²日本东海大学医学院Isehara肌肉生理学和细胞生物学研究室；日本东海大学医学院Isehara骨科。
^三日本东海大学医学院Isehara肌肉生理学和细胞生物学研究室；日本东海大学医学院Isehara人体结构与功能系；日本东海大学医学院Isehara骨科。
⁴日本东海大学医学院Isehara肌肉生理学和细胞生物学研究室；日本石原东海大学医学院泌尿系。
⁵日本石原东海大学医学院泌尿系。
⁶日本东海大学医学院Isehara骨科。

PMID： 26082721
PMCID公司：项目经理4451695
内政部： 10.3389/fphys.2015.00165

人骨骼肌源性干细胞的治疗性分离和扩增用于肌-神经血管重建

田木哲郎等。前生理学. 2015.

.2015年6月2日6:165。

doi:10.3389/fphys.2015.00165。 2015年电子收集。

作者

田木哲郎¹, 内山义彦², 平田真司^三, 桥本裕久², 中岛信义⁴, 斋藤小介⁴, Toshiro Terachi先生⁵, Joji Mochida公司⁶

附属公司

¹日本东海大学医学院Isehara肌肉生理学和细胞生物学研究室；日本东海大学医学院Isehara人体结构与功能系。
²日本东海大学医学院Isehara肌肉生理学和细胞生物学研究室；日本东海大学医学院Isehara骨科。
^三日本东海大学医学院Isehara肌肉生理学和细胞生物学研究室；日本东海大学医学院Isehara人体结构与功能系；日本东海大学医学院Isehara骨科。
⁴日本东海大学医学院Isehara肌肉生理学和细胞生物学研究室；日本石原东海大学医学院泌尿系。
⁵日本石原东海大学医学院泌尿系。
⁶日本东海大学医学院Isehara骨科。

PMID： 26082721
PMCID公司：项目经理4451695
内政部： 10.3389/fphys.2015.00165

摘要

骨骼肌占体重的40-50%，因此被认为是一种良好的成人干细胞来源，用于自体治疗。尽管从小鼠骨骼肌中分离出了一些干/祖细胞，显示出很高的治疗应用潜力，但尚不清楚人类是否存在这种情况。研究了人骨骼肌源性细胞（Sk-Cs）的分化和治疗潜力。样本（5-10克）取自36名接受前列腺癌治疗或截肢手术的患者（年龄17-79岁）的腹部和腿部肌肉。所有患者均表示知情同意。使用条件胶原酶溶液分离Sk-C，然后按照与先前小鼠Sk-C相似的方式将其分为CD34（-）/CD45（-）/CD29（+）（Sk-DN/29（+））和CD34（+）/CD45-（Sk-34）细胞。使用条件培养基将两种细胞组分适当扩增约2周。然后在细胞培养和体内移植到无胸腺裸鼠和大鼠严重受损的肌肉中的过程中检测分化潜能。有趣的是，这两种细胞组分可分为高度肌源性（Sk-DN/29（+））和多能干细胞（Sk-34）组分，而小鼠Sk-Cs在两种细胞中表现出相似的能力。两种细胞组分分别移植6周后，前者对肌纤维再生有积极的贡献，但后者对与分化为雪旺细胞、神经周/神经内细胞、血管内皮细胞和周细胞相关的间质有强烈的植入作用，这与之前对小鼠SK-Cs的观察结果一致。重要的是，两种细胞的混合培养导致体内组织重建能力的降低，而单独扩增后的联合移植显示出良好的结果。因此，人Sk-C可能适用于治疗性自体移植，并在体内显示出多重分化潜能。

关键词：肌营养不良；Pax7；成体干细胞；人核抗原；肌间质；第75页；卫星小区。

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数字

图1
**CD标记在新分离和扩增的（第1代）Sk-Cs中的表达。（A）**新分离的总细胞在11个标记中有6个阳性，主要标记为CD29和CD34；因此，这些被用于随后的细胞分离。然而，在培养Sk-DN/29后，这些标记的表达发生了显著变化⁺和Sk-34/29^+/−细胞，但重要的是，两个细胞的特征在膨胀后是相似的。**（B）**排除CD45的实际排序⁺细胞，如造血细胞。**（C）**3种细胞组分的基本分类模式，如Sk-DN/29⁺，Sk-34/29⁺和Sk-34/29⁻在本研究中一直使用。数据来自21名受试者/32份样本（男性n个19岁，年龄21–79岁；女性n个=2岁，年龄17-69岁，来自腹部肌肉n个=16，腿部肌肉n个= 5).

图2
**三种细胞组分在培养中的典型细胞行为。（A、B）**Sk-DN/29号⁺,**（C、D）**Sk-34/29型⁺,**（E、F）**Sk-34/29号⁻、和**（G）**Sk-34（29^+/−). 4种细胞组分的细胞行为明显不同。左栏显示了条件培养基中扩张培养2周后的结果。右栏显示了不含任何额外细胞因子的对照培养基（仅含抗生素的IMDM/20%FCS）。与对照组相比，在条件培养基中，每个细胞组分的细胞增殖明显良好。然而，Sk-34/29⁻细胞增殖显著降低**（E）**，但当两个Sk-34细胞（29^+/−)制备用于联合培养，获得了改善的细胞融合**（G）**.Sk-DN/29的行为⁻细胞也显示在补充图1中。棒材=100μm。在该分析中，来自22名受试者/38个样本（男性n个20岁，年龄21–79岁；女性n个=2岁，年龄17-69岁，来自腹部肌肉n个=16，腿部肌肉n个=6）。

图3
**Pax7-和MyoD-阳性细胞在Sk-DN/29中的分布⁺和Sk-34馏分**Pax7在Sk-DN/29中的典型表达⁺ **（A、B）**和Sk-34（C、D）第1代细胞。**（A、C）**细胞分裂素制剂。**（B、D）**培养皿准备。大量Pax7⁺在Sk-DN/29中观察到细胞⁺细胞，但在Sk-34中很少见到。请注意，Pax7阳性的细胞通常包含几个弱反应（如箭头所示A类和C类). 这种趋势在胞浆或培养皿制备中都没有改变。**（E）**Pax7数量的连续变化⁺和MyoD⁺显示了从PO到P4的单元格，用总单元格的百分比表示。在Sk-DN/29中可检测到强大的肌生成潜能⁺细胞，但在Sk-34中较弱。棒材=50μm。数据来自11个样本（M40-VM，VL；M45-TA，G；M57-A；M58-A；M59-A；M6 1-A；F17-TA，S，G）。

图4
**Sk-DN/29肌管形成试验⁺和Sk-34细胞。（A、B）**Sk-DN/29号⁺.（C、D）Sk-34细胞。Sk-DN/29中有许多多核肌管形成⁺细胞，但在Sk-34细胞中很少。Sk-DN/29的肌生成潜能很强⁺细胞，但在Sk-34细胞中很弱。还观察到单个MyoD阳性细胞（箭头）。棒材=50μm。数据来自11个样本（M67-A，VL；M45-TA，G；M57-A；M58-A；M59-A；M6 1-A；F17-TA，S，G）。

图5
**Sk-DN/29的RT-PCR分析⁺和扩张培养前后的Sk-34细胞**黑色条表示肌源性标记，蓝色条表示外周神经，红色条表示血管标记。绿色表示三个谱系中常见的标记。表达强度根据管家控制基因（GAPDH）进行标准化，并取平均值。这些数据支持免疫细胞化学分析和肌管形成试验的结果。此外，很明显，Sk-DN/29⁺细胞由新分离状态下的已整合成肌细胞组成（见上文），但Sk-34细胞不包括肌细胞。数据来自21名受试者/36份样本（男性n个20岁，年龄21–79岁；女性n个=1岁，17岁，来自腹部肌肉n个=16，腿部肌肉n个= 5).

图6
**Sk-DN/29的典型植入⁺移植后6周受损肌肉中的细胞。（A）**移植部分的宽视图。粉红色=HNA（人类核抗原），绿色=层粘连蛋白（基底膜染色）和蓝色（DAPI核染色）。大多数HNA⁺细胞核位于肌纤维的基底层。面板**（B、C）**显示用HNA+层粘连蛋白+DAPI染色的相同区域**（B）**和SkActin（骨骼肌肌动蛋白）+层粘连蛋白**（C）**在更高的放大倍数下拍摄。氢萘二甲酸⁺细胞核清楚地位于肌肉纤维中（箭头所示）。M17-VM=男性，17岁，股外侧肌。棒材=50μm。

图7
**移植后6周在受损肌肉中典型植入Sk-34细胞。（A）**移植部分的宽视图。粉红色=HNA（人类核抗原），绿色=层粘连蛋白（基底层染色），蓝色（DAPI核染色）。大多数HNA⁺细胞核位于肌肉间质间隙（肌纤维基底膜外侧）。**（B、C）**显示用HNA+p75（绿色，Schwan细胞标记）+DAPI染色的相同区域**（B）**和HNA+SMA（绿色，平滑肌肌动蛋白，血管平滑肌标记物）+DAPI（C）在更高的放大倍数下拍摄。与HNA和p75共培养是明显的，表明植入的人类细胞的雪旺细胞分化（箭头所示B类). 在(C类，箭头），从而表明移植细胞分化为血管平滑肌细胞。F17-G=女性，17岁，腓肠肌。棒材=50μm。

图8
**Sk-34细胞移植后6周用高倍免疫荧光检测细胞分化**. (A类，箭头）SMA⁺/海航集团⁺位于血管周围的细胞显示移植的人类细胞分化为血管平滑肌细胞。(B类，箭头）反人类CD31⁺/氢萘二甲酸⁺血管周围也观察到细胞分化为血管内皮细胞。(C类，箭头）NG2⁺/海航集团⁺位于鼠标CD31周围的单元格⁺血管，显示向周细胞分化。(D类，箭头）p75⁺/海航集团⁺细胞也位于髓鞘附近（MBP⁺)，显示分化为施旺细胞。F17-S，G，TA=17岁女性，比目鱼肌，腓肠肌，胫骨下。棒材=20μm。

图9
**检测含有HNA的细胞⁺用免疫电镜观察Sk-34细胞移植6周后的细胞核。（A）**相对较宽的间隙。**（B）**相对狭窄的间质。海航集团⁺用DAB可视化反应；因此，它们显示为黑点。插入面板的数字和字母与照片底部列出的细胞和/或组织相对应。分化为1-6个细胞系得到证实。箭头在**（A）**显示HNA阴性细胞核，无黑点。海航集团确定详情⁺免疫电子显微镜下的细胞如补充图2所示。F17-G=女性，17岁，腓肠肌。条形图英寸A类=20μm，英寸B类=5微米。

**图10**
**人类Sk-DN/29的典型植入⁺和Sk-34细胞在联合移植后8周。（A）**共同移植到裸鼠严重受损的胫骨前肌（TA）。**（B）**裸鼠胫骨前肌严重损伤联合移植。海航的有利和积极移植⁺在两种移植条件下均观察到细胞核进入肌纤维和间质。因此，在Sk-DN/29的联合移植中具有协同效应⁺和Sk-34细胞，而共扩增培养结果较差。这与单独移植小鼠Sk-DN或Sk-34细胞的情况类似（参见参考文献。Tamaki等人，2005年，2007年a，b）。与单人Sk-DN/29相比⁺图6中的移植，包括HNA在内的纤维数量⁺原子核可能很低。这可能取决于一个原因，即在对单独移植的总细胞数进行调整的情况下，由于Sk-DN+Sk34细胞的添加，移植的Sk-DN细胞的数量绝对减少了一半。

**图11**
**Sk-34（A）和Sk-DN/29的细胞倍增⁺（B）单元格**注意，并不是所有的样本都出现了，因为有些样本直接用于体内移植研究，部分用于免疫细胞化学研究。

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