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。2015年5月；35(5):1246-56.
doi:10.3892/ijmm.2015.2135。 Epub 2015年3月13日。

瘢痕疙瘩衍生的角质形成细胞在体外缺氧微环境中获得成纤维细胞样外观和增强的侵袭能力

马晓阳 1, 贾晨 1, 贝旭 1, 小龙 1, 韩勤 2, 赵春华（Robert Chunhua Zhao） 2, 王晓军 1
附属机构

瘢痕疙瘩衍生的角质形成细胞在体外缺氧微环境中获得成纤维细胞样外观和增强的侵袭能力

马晓阳等。 国际分子医学杂志。 2015年5月。

摘要

瘢痕疙瘩疤痕是在伤口周围形成的致密纤维组织的过度生长。这些疤痕是隆起的疤痕，通过侵袭从原始伤口边缘扩散到正常皮肤。瘢痕疙瘩组织由上皮细胞和真皮成纤维细胞组成。最近的研究主要集中于瘢痕疙瘩成纤维细胞；然而，角质形成细胞在瘢痕疙瘩侵袭过程中的确切作用尚待确定。缺氧是瘢痕疙瘩疤痕和其他实体瘤的典型特征。转录因子低氧诱导因子-1α（HIF-1α）的表达主要由缺氧诱导，以其诱导细胞增殖和转化变化的能力而闻名；其表达与肿瘤侵袭转移有关。在本研究中，我们使用免疫组织化学、荧光染色和western blot分析，证明HIF-1α在瘢痕疙瘩组织标本的上皮层和低氧暴露的角质形成细胞中都有高表达，这表明瘢痕疙榔角化细胞经历了上皮-间充质转化（EMT）体外试验。通过蛋白质和mRNA水平的检测，证实了间充质标志物（如波形蛋白和纤维连接蛋白）的高表达，以及在此过程中E-cadherin和闭塞小带-1（ZO-1）的表达降低。此外，以HIF-1α为靶点的siRNA逆转了角质形成细胞的形态变化（细胞具有成纤维细胞样外观），并抑制了角质化细胞的侵袭能力。总之，本研究结果表明，缺氧/HIF-1α微环境为瘢痕疙瘩衍生角质形成细胞通过EMT形成成纤维细胞样外观提供了有利的环境。这种转变可能是导致瘢痕疙瘩角质形成细胞侵袭能力增强的原因，使瘢痕疙榔扩展到创面边缘以外。

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图1
图1
瘢痕疙瘩瘢痕组织上皮-间充质转化（EMT）标记物和低氧诱导因子-1α（HIF-1α）表达分析。瘢痕疙瘩组织标本中（a）HIF-1α、（b）波形蛋白、（c）E-钙粘蛋白和（d）纤连蛋白的免疫组织化学染色。
图2
图2
瘢痕疙瘩角质形成细胞的形态学变化。瘢痕疙瘩角质形成细胞在常氧（21%O2)和缺氧条件（1%O2). （a） 在常氧条件下，瘢痕疙瘩角质形成细胞呈现典型的鹅卵石样生长模式的上皮细胞形态。（b） 一些瘢痕疙瘩角质形成细胞在12小时时获得纺锤形成纤维细胞样形态。
图3
图3
瘢痕疙瘩角质形成细胞上皮-间充质细胞转化（EMT）标记物和低氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因表达的变化分析。瘢痕疙瘩角质形成细胞在常压（21%O2)和缺氧条件（1%O2)不同时间段（12、24和36小时）。显示瘢痕疙瘩角质形成细胞中（a）波形蛋白、（b）纤维连接蛋白、（c）E-cadherin、（d）闭塞带-1（ZO-1）和（E）HIF-1α的相对mRNA表达*与正常氧条件下的角质形成细胞相比，P<0.05（21%O2). 条形代表3个独立实验的平均值±SD。
图4
图4
（A） 瘢痕疙瘩角质形成细胞上皮-间充质细胞转化（EMT）标记物和低氧诱导因子-1α（HIF-1α）蛋白表达的变化分析。（a） 瘢痕疙瘩角质形成细胞在常压（21%O2)和缺氧条件（1%O2)用于不同的时间段（12、24和36小时）。瘢痕疙瘩角质形成细胞中有（b）HIF-1α、（c）波形蛋白、（d）纤维连接蛋白、（e）e-cadherin和（f）闭塞带-1（ZO-1）的表达*与正常氧条件下的角质形成细胞相比，P<0.05（21%O2). 条形代表3个独立实验的平均值±SD。（B） 正常氧条件下瘢痕疙瘩角质形成细胞的表型检测（21%O2)免疫荧光染色。在正常氧条件下培养36小时后，瘢痕疙瘩角质形成细胞的细胞核或细胞质中未检测到HIF-1α和EMT相关标记物的表达。未检测到HIF-1α、波形蛋白和纤维连接蛋白的表达。相反，E-cadherin和ZO-1在倒置荧光显微镜下正常表达和检测。（C） 缺氧条件下瘢痕疙瘩角质形成细胞的EMT表型检测（1%O2)免疫荧光染色。缺氧条件下培养36小时后，瘢痕疙瘩角质形成细胞的细胞核和细胞质中HIF-1α、波形蛋白和纤维连接蛋白的蛋白表达积累。倒置荧光显微镜下观察到，与在常压条件下培养的细胞相比，E-cadherin和ZO-1的表达降低。
图4
图4
（A） 瘢痕疙瘩角质形成细胞上皮-间充质转化（EMT）标志物和缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）蛋白表达变化的分析。（a） 瘢痕疙瘩角质形成细胞在常压（21%O2)和缺氧条件（1%O2)不同时间段（12、24和36小时）。瘢痕疙瘩角质形成细胞中有（b）HIF-1α、（c）波形蛋白、（d）纤维连接蛋白、（e）e-cadherin和（f）闭塞带-1（ZO-1）的表达*与正常氧条件下的角质形成细胞相比，P＜0.05（21%O2). 条形代表3个独立实验的平均值±SD。（B） 正常氧条件下瘢痕疙瘩角质形成细胞的表型检测（21%O2)免疫荧光染色。在正常氧条件下培养36小时后，瘢痕疙瘩角质形成细胞的细胞核或细胞质中未检测到HIF-1α和EMT相关标记物的表达。未检测到HIF-1α、波形蛋白和纤维连接蛋白的表达。相反，E-cadherin和ZO-1在倒置荧光显微镜下正常表达和检测。（C） 缺氧条件下瘢痕疙瘩角质形成细胞的EMT表型检测（1%O2)免疫荧光染色。缺氧条件下培养36小时后，瘢痕疙瘩角质形成细胞的细胞核和细胞质中HIF-1α、波形蛋白和纤维连接蛋白的蛋白表达积累。倒置荧光显微镜下观察到，与在常压条件下培养的细胞相比，E-cadherin和ZO-1的表达降低。
图4
图4
（A） 瘢痕疙瘩角质形成细胞上皮-间充质细胞转化（EMT）标记物和低氧诱导因子-1α（HIF-1α）蛋白表达的变化分析。（a） 瘢痕疙瘩角质形成细胞在常压（21%O2)和缺氧条件（1%O2)不同时间段（12、24和36小时）。瘢痕疙瘩角质形成细胞中有（b）HIF-1α、（c）波形蛋白、（d）纤维连接蛋白、（e）e-cadherin和（f）闭塞带-1（ZO-1）的表达*与正常氧条件下的角质形成细胞相比，P＜0.05（21%O2). 条形代表3个独立实验的平均值±SD。（B） 正常氧条件下瘢痕疙瘩角质形成细胞的表型检测（21%O2)免疫荧光染色。在正常氧条件下培养36小时后，瘢痕疙瘩角质形成细胞的细胞核或细胞质中未检测到HIF-1α和EMT相关标记物的表达。未检测到HIF-1α、波形蛋白和纤维连接蛋白的表达。相反，E-cadherin和ZO-1在倒置荧光显微镜下正常表达和检测。（C） 缺氧条件下瘢痕疙瘩角质形成细胞的EMT表型检测（1%O2)免疫荧光染色。缺氧条件下培养36小时后，瘢痕疙瘩角质形成细胞的细胞核和细胞质中HIF-1α、波形蛋白和纤维连接蛋白的蛋白表达积累。倒置荧光显微镜下观察到，与在常压条件下培养的细胞相比，E-cadherin和ZO-1的表达降低。
图5
图5
HIF-1αsiRNA-转染瘢痕疙瘩角质形成细胞中上皮-间充质细胞转化（EMT）标记物和低氧诱导因子-1α（HIF-1β）蛋白表达的分析。HIF-1αsiRNA抑制HIF-1 a的表达，并伴有EMT相关蛋白的表达降低。（a） 在暴露于缺氧孵育36小时之前，用HIF-1αsiRNA或对照扰乱siRNA转染类角质形成细胞。对其进行分析并与未转染的角质形成细胞进行比较。瘢痕疙瘩角质形成细胞中（b）HIF-1α、（c）波形蛋白、（d）纤维连接蛋白、（e）e-cadherin和（f）闭塞带-1（ZO-1）的表达。*与36小时低氧暴露的角质形成细胞相比，P<0.05，并且对照组角质形成上皮细胞被打乱转染。条形代表3个独立实验的平均值±SD。
图6
图6
转染瘢痕疙瘩角质形成细胞的形态学变化。在低氧条件下孵育36 h之前，用低氧诱导因子-1α（HIF-1α）siRNA或对照干扰siRNA转染瘢痕疙瘩角质形成细胞。在相同培养条件下，将形态学变化与未转染的角质形成细胞进行比较。（a） 未经转染的瘢痕疙瘩角质形成细胞在缺氧36小时时表现出细长的纺锤形成纤维细胞样形态。（b） HIF-1αsiRNA-转染的角质形成细胞保持其鹅卵石形状。（c） 对照组干扰siRNA角质形成细胞仍显示梭形形态（×40倍放大）。
图7
图7
通过Matrigel共培养箱研究细胞侵袭性。将侵袭细胞固定并用结晶紫染色。（a） 正常氧条件下瘢痕疙瘩角质形成细胞的侵袭（21%O2). （b–d）缺氧条件下培养的瘢痕疙瘩角质形成细胞的侵袭（1%O2)分别持续12、24和36小时。（e） 柱显示了在常氧和缺氧培养条件下（12、24和36小时）从入侵的瘢痕疙瘩角质形成细胞中洗脱出来的结晶紫的光密度（OD）。*与正常氧条件下的角质形成细胞相比，P<0.05（21%O2). 条形图表示3个独立实验的平均值±标准差。
图8
图8
通过Matrigel共培养箱检测转染角质形成细胞的侵袭性。在低氧条件下孵育36 h之前，用低氧诱导因子-1α（HIF-1α）siRNA或对照干扰siRNA转染瘢痕疙瘩角质形成细胞。将侵袭细胞固定并用结晶紫染色。（a） 低氧条件下未转染瘢痕疙瘩角质形成细胞的侵袭（1%O2). （b） 侵袭HIF-1αsiRNA-转染的角质形成细胞和（c）侵袭对照组打乱siRNA转染的角朊细胞。（d） 柱显示了从缺氧条件下培养36小时的侵袭性瘢痕疙瘩角质形成细胞中洗脱出来的结晶紫的光密度（OD）。*与36小时低氧暴露的角质形成细胞相比，P<0.05，并且对照组角质形成上皮细胞被打乱转染。条形代表3个独立实验的平均值±SD。
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