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.2014年12月11日；5（12）：e1567。
doi:10.1038/cddis.2014.521。

低氧培养的人脂肪间充质干细胞是非致癌性的，具有增强的生存能力、运动能力和对脑癌的倾向性

Y Feng先生 1, M Zhu先生 2, S Dangelmajer先生 三, Y M Lee先生 三, O威杰塞克拉 三, C X卡斯特拉诺斯 三, 登杜鲁里 三, K L Chaichana公司 三, Q李 三, H张 4, 列夫琴科 5, 格雷罗·卡萨雷斯 三, Quiñones-Hinojosa公司 三
附属公司

低氧培养的人脂肪间充质干细胞是非致癌性的，具有增强的生存能力、运动能力和对脑癌的倾向性

Y Feng先生等。 细胞死亡病. .

勘误表in

摘要

成人脂肪间充质干细胞（hAMSC）是一种多能干细胞，数量丰富，易于收集，绕过了困扰胚胎干细胞的伦理问题。它们的实用性和可获得性促使临床研究迅速发展，以探索其基于自体和异体细胞的再生潜力、组织保存能力、抗炎特性和抗癌特性等。hAMSC通常在含21%氧气的环境条件下培养。然而，从生理上讲，hAMSC存在于一个氧张力低得多的环境中。此外，在标准条件下培养的hAMSC显示出有限的增殖和迁移能力，以及有限的生存能力。本研究探讨了低氧培养条件对术中获得的原代hAMSC的影响。低氧培养的hAMSCs（hAMSCs-H）保持多能性，能够分化为成骨、成软骨和成脂肪细胞系。此外，hAMSCs-H生长更快，细胞死亡更少。此外，hAMSCs-H比正常氧培养的hAMSCs具有更强的运动能力，并且在体内外对来自患者脑肿瘤起始细胞的胶质母细胞瘤（GBM）具有更强的归巢能力。重要的是，hAMSCs-H在体外没有转化为肿瘤相关的成纤维细胞，在体内也没有致瘤性。相反，hAMSCs-H在体内外促进了脑癌细胞的分化。这些发现提示了一种可增强hAMSC功能的替代培养技术，这可能是hAMSC用于治疗各种疾病（包括中风、心肌梗死、肌萎缩侧索硬化和GBM）所必需的。

PubMed免责声明

利益冲突声明

其他作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
低氧和常氧条件下培养的原代人脂肪衍生细胞（hAMSCs-H）均为MSCs，但与低氧培养细胞相比，常氧培养细胞显示出更多的衰老迹象，如面积增加和形态拉长。(一)hAMSC从人脂肪组织中分离出来，并在低氧（1.5%氧气）或常氧（21%氧气）条件下培养在体外随后比较了生存能力、移动性、肿瘤嗜性、安全性和致瘤潜力在体外和体内. (b条)分化试验。第二代传代后10天，在对照培养基和分化培养基中培养hAMSC 3周。进行三种不同的染色以评估分化能力（比例尺，100 μm） ●●●●。(c（c）)流式细胞术分析证实两种细胞培养物中均无CD31-、CD34-和CD45-阳性细胞。此外，在第2代后的第10天，在缺氧和常氧培养条件下，原代hAMSC培养物均表达高水平的CD73、CD90和CD105。(d日)二维表面上hAMSC细胞形态的代表性图像（比例尺，200 μm） ●●●●。(e（电子）)用于评估形态学和运动性的3D纳米图形表面示意图。(（f）)三维纳米图形表面上hAMSC的细胞形态图像（比例尺，200 μm） ●●●●。(克–j个)细胞在纳米图案表面对齐后，测量并比较长度、宽度、面积和长宽比。误差条代表S.E.M*P（P）<0.05, **P（P）<0.01，N.S.，不显著
图2
图2
在缺氧条件下培养的原代hAMSCs生长更快，具有更高的生存能力，并且可以传代更多代在体外. (一)hAMSCs-H具有较短的P1和P2传代时间。当细胞达到80%的汇合点时，计算P0的通过时间 消化g脂肪组织并以0.6×10的密度播种4/厘米2分别在缺氧或常压条件下。当达到80%的汇合时，确定P1和P2的通过时间。(b条)传代加倍时间分析。hAMSCs-H有一个恒定的PDT（<4天），最多可传代20次。PDT（PDT）=τLn（2）/Ln(N个τ/N个0)，其中τ=从电镀到细胞计数的时间，N个τ=计数时的单元格数量N个0=初始单元格数。(c（c）)MTT法检测缺氧对人AMSC增殖能力的影响。(d日和e（电子）)Ki-67免疫染色用于量化增殖细胞的数量。代表性图像（比例尺，100 μm） 显示了hAMSC的增殖百分比。(（f）和克)Annexin V–FITC-阳性和PI-阴性细胞的流式细胞术凋亡分析。显示了代表性直方图和定量。(小时和我)PI染色检测细胞周期和坏死率。显示了具有代表性的直方图和量化。误差条代表S.E.M*P（P）<0.05, **P（P）<0.01，N.S.，不显著
图3
图3
低氧培养的原代人脂肪间充质干细胞（hAMSCs-H）在接触GBM培养基时，与正常氧培养的原始hAMSCs（hAMSC s-N）相比，保留了更大的增殖能力。hAMSCs-H在接触GBM培养基时保持干细胞特性。(一)患者GBM的典型MRI。(b条)显示GBM CM收集和hAMSC培养的模式，用于增殖和迁移分析。(c（c）)MTT法检测低氧条件对GBM CM原代hAMSCs增殖能力的影响(d日)Ki-67免疫染色用于量化GBM CM中增殖细胞的数量。GBM CM显示了hAMSCs-H和hAMSCs-N的增殖能力（在对照培养基中归一化为hAMSC-N增殖能力）。在GBM-CM中，hAMSCs-H的增殖细胞比例高于hAMSCs-N(e）分化测定。hAMSC在对照培养基、分化培养基和GBM-CM中培养3周，第二代后10天。进行三种染色以评估分化能力（比例尺，100 μm） ●●●●。hAMSCs-N和hAMSCs-H在GBM-CM中均保持了三线分化能力(（f）)接触GBM CM 20天后，流式细胞术分析hAMSC-N和hAMSC-H培养物中的CD31、CD34、CD45、CD73、CD90和CD105。hAMSCs-H在GBM CM中保持MSC表型标记（CD31、CD34和CD45为阴性，CD73、CD90和CD105为阳性）。错误条代表S.E.M.错误条代表SEM*P（P）<0.05, **P（P）<0.01，N.S.，不显著
图4
图4
hAMSC媒体促进GBM差异化体外试验。GBM在hAMSC介质中的增殖和迁移能力保持不变。体内，GBM细胞暴露于原代hAMSCs-H后，向星形细胞系分化增加（GFAP水平增加，Nestin水平降低）。(一)采用MTT法检测hAMSC培养基对GBM增殖能力的影响。(b条)Ki-67免疫染色用于量化hAMSC培养基中增殖GBM细胞的数量。对照培养基、hAMSC-N CM和hAMSC-H CM之间的增殖GBM细胞比例没有差异(c（c）)对AMSC CM中的GBM细胞进行Nestin、GFAP和Tuj1免疫染色(d日–（f）)hAMSC CM中GBM细胞Nestin、GFAP和Tuj1标记物的定量。hAMSC-H CM中的GBM分化程度高于对照培养基，表现为Nestin减少，GFAP增加，Tuj1表达增加。(克)对小鼠脑切片进行Nestin、GFAP和Tuj1免疫染色，以测试GBM276细胞的分化体内与注射hAMSCs-N的小鼠相比，注射hAMSC S-H的小鼠的GBM276细胞向星形细胞系分化更大。比例尺为100 μ米(小时–j个)GFAP的量化+/人体细胞核+、雀巢+、GFAP+、和Tuj1+细胞
图5
图5
原发性hAMSC不会致癌，也不会转化为TAF在体外或体内. (一)hAMSC在GBM-CM或对照培养基中培养2周，并进行western blotting（GAPDH作为对照）以量化TAF标记物（波形蛋白和sm-actin）。(b条)PBS的实验示意图(n个=6），hAMSCs-H(n个=7）或hAMSCs-N(n个=8）（两个hAMSCs组均用GFP/荧光素酶标记）注射到小鼠体内。老鼠(n个每组=3只）在第10天分离并处死。在第1天、第7天、第14天和第28天检查各组其余小鼠的生物发光，然后在第60天处死。(c（c）–（f）)hAMSC的活体动物成像。hAMSCs-H在第1天到第7天之间保持生物发光亮度(P（P）=0.165），而hAMSCs-N显著下降(P（P）<0.01). (克和小时)波形蛋白、sm-actin、GFP和人类核染色用于缺氧和常压组。hAMSCs-N组和hAMSCs-H组在第60天均未发现hAMSCs。在第60天未观察到hAMSC标记物（GFP/Ki-67与人类细胞核）或TAF标记物（波形蛋白和sm-actin）的阳性染色。误差条代表SEM*P（P）<0.05, **P（P）<0.01，N.S.，不显著
图6
图6
缺氧增强了原代hAMSC的迁移能力。(一)2D-划痕试验。不同hAMSC组的板被刮伤5次 mm的边缘空间和划痕的边界立即被标记出来。然后，在24小时结束时，用明亮视野显微镜拍摄照片 h（比例尺，200 μm） ●●●●。(b条)I、II和III区hAMSCs-H和hAMSCs-N迁移比例的比较(c（c）)hAMSCs-H和hAMSCs-N组的代表轨道。使用延时显微镜在3D纳米图形表面上定量细胞迁移。自动记录图像6 每隔10分钟检查一次。(d日–（f）)通过追踪每组75个细胞来评估速度、持久性和距离。误差条代表S.E.M*P（P）<0.05, **P（P）<0.01，N.S.，不显著
图7
图7
初级hAMSCs-H对GBM-CM的取向在体外和GBM体内增加。(一)博伊登室跨阱分析示意图。(b条和c（c）)Boyden室transwell测定的代表性图像和定量图。hAMSC（2×104)在顶部井中播种，而在底部井中放置GBM CM或对照培养基。培养24小时后，对底部的细胞进行染色和定量。(d日)的示意图体内实验。(e（电子）)对小鼠脑切片进行GFP和人细胞核的免疫染色，以测试原代hAMSC对GBM276肿瘤体积的嗜性体内与hAMSCs-N相比，hAMSCs-H对肿瘤体积的倾向性增强。比例尺为100 μ米(（f）)GFP百分比的量化+/人体细胞核+每个字段的单元格。误差条代表S.E.M*P（P）<0.05, **P（P）<0.01，N.S.，不显著
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