跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https公司

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
。2015年1月2日；290(1):396-408.
doi:10.1074/jbc。M114.566349。 Epub 2014年11月17日。

SIRT1-RELB-SIRT3在急性炎症和脓毒症免疫代谢适应过程中的顺序作用协调核-线粒体通讯

刘铁福 1, 维杜拉·瓦什哈拉贾尼 2, 帕特里克·米勒 三, 曼尼什·S·巴拉德瓦吉 4, 安东尼·莫利纳 4, 查尔斯·麦考尔 5
附属机构

SIRT1-RELB-SIRT3在急性炎症和脓毒症免疫代谢适应过程中的顺序作用协调核-线粒体通讯

刘铁福等。 生物化学杂志。 。

摘要

我们报道单核细胞中NAD（+）依赖性SIRT1、RELB和SIRT6核蛋白调节从糖酵解依赖性急性炎症反应到脂肪酸氧化依赖性脓毒症适应的转换。我们还发现，在适应过程中破坏SIRT1活性可以恢复免疫代谢稳态，并使脓毒症小鼠免于死亡。在这里，我们表明，核SIRT1引导RELB差异诱导SIRT3表达，并增加线粒体生物生成，从而改变脓毒症适应期间的生物能量学。我们使用TLR4刺激的THP1人前体细胞构建了这一概念，该模型模拟了脓毒症的起始和适应阶段。增加表达后，线粒体SIRT3脱乙酰酶激活速率限制性三羧酸循环（TCA）异柠檬酸脱氢酶2和超氧化物歧化酶2，同时柠檬酸合成酶活性增加。线粒体耗氧量在适应过程中早期增加，随后降低，同时改变膜去极化、ATP生成和线粒体超氧化物和全细胞过氧化氢的生成。SIRT1-RELB诱导线粒体生物发生的证据包括线粒体质量、线粒体与核DNA比率以及核蛋白和线粒体编码蛋白的增加。我们在TLR4刺激的正常和脓毒症适应的人血单核细胞和小鼠脾细胞中证实了SIRT-RELB-SIRT3适应与线粒体生物能量学的联系。我们还发现体外SIRT1抑制逆转了败血症诱导的生物能量学变化。

关键词：急性炎症；线粒体生物能学；线粒体呼吸链复合体；单核细胞；核-心灵沟通；RELB；活性氧（ROS）；SIRT3；败血症；Sirtuin 1（SIRT1）。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
线粒体生物能量学的双相转变伴随着炎症适应。用1μg/ml的LPS刺激THP-1细胞达指定时间，跨越从急性开始（0-8小时）到急性适应后（8-24小时）的表型转变。A、，使用细胞线粒体应激试剂盒分析线粒体OCR中急性炎症反应诱导的动态变化。B从基础OCR中减去寡霉素治疗后的OCR计算ATP生成。C、，生化分析法评价线粒体ATP生成动力学体外试验。D、，共焦显微镜分析线粒体膜电位的改变(左侧面板)和流式细胞术(右侧面板; 数据在0小时标准化），使用MitoTracker红色染料。E、，共聚焦显微镜评价线粒体超氧化物的产生(左侧面板)和流式细胞术(右侧面板; 数据在0小时标准化），使用Mito-Sox红色染料。F、，二醋酸二氯荧光素染色的线粒体超氧化物和细胞过氧化氢生成的荧光显微镜研究。G、，添加ETC-偶联剂FCCP后，通过基础OCR和最大OCR（LPS后8小时）之间的差异确定线粒体SRC。H、，TRL4反应过程中纯化线粒体ETC呼吸的动态变化。从用或不用LPS处理8小时的THP-1细胞中分离线粒体。按照“实验程序”中的描述，在等量（10μg）的线粒体蛋白中分析生物能量学插入显示线粒体制剂的纯度。中的数据一个,B,C,G公司、和H（H）是三个独立实验之一的四个重复井的平均值±S.E。流式细胞术数据C和D类是三个独立实验的平均值±S.E。单向方差分析对中的值A–E描述了跨时间点的重要性；随后未成对t吨测试确定了0h和其他时间点之间的显著性。中的AUCF类和G公司由XF软件进行分析。*，对< 0.05; **,对< 0.01; ***,对< 0.001; #,对> 0.05; ∧ 表示对>与LPS后4小时的OCR相比，0.05。
图2。
图2。
随着炎症适应，线粒体生物生成和酶激活增加。用1μg/ml的LPS刺激THP-1细胞达到指定时间。A、，TLR4激活后0、4、8和24小时用MitoTracker Green染料测定线粒体质量的流式细胞术分析。B、，脂多糖诱导线粒体与核DNA比率的变化。C，核DNA编码的IDH的免疫印迹2、超氧化物歧化酶2和结构蛋白VDAC在0到24小时之间的时间点探测。D、，LPS诱导线粒体DNA编码NADH脱氢酶亚基6和核DNA编码复合物IV的表达。E、，全细胞裂解液中ETC复合蛋白的动态变化(左侧面板)和纯化的线粒体(右侧面板)在TLR4应答过程中。F、，LPS诱导的印尼盾2,草地2、和VDAC公司通过RT-PCR分析。脂多糖诱导的IDH变化2(G公司)、超氧化物歧化酶2(H（H）)和柠檬酸合成酶(我)对活性进行了生物化学评估在体外。在C,D类、和左侧面板属于E类以β-actin为负荷控制；以Cox-IV作为负荷对照分析分离的线粒体蛋白(E类,右侧面板). 三个实验之一如所示A-C公司; 两个实验之一如所示D类,E类,G公司,H（H）、和我; 五个实验之一如所示F类.单向方差分析对显示值以确定跨时间点的重要性。0小时和其他时间点之间的显著性由随后的不配对决定t吨测试，*，对< 0.05; **,对< 0.01; ***,对< 0.001; #,对> 0.05.
图3。
图3。
SIRT3的表达和激活随着炎症适应而增加。使用或不使用1μg/ml LPS刺激THP-1细胞达到指定时间。A、，LPS诱导SIRT3号机组基因转录。B、，Western blot分析LPS诱导的SIRT3蛋白变化。C、，使用兔IgG真核抗体开发的抗乙酰赖氨酸抗体，在LPS后基线、4和24小时，对代表性线粒体速率限制酶进行脱乙酰化激活。手机总IDH2和SOD2与抗IDH共同免疫沉淀2或抗SOD2抗体。中的数据一个显示为五个实验的平均值±S.E。五个实验之一如所示B，三个实验之一如所示C.单因素方差分析对中的值一个确定SIRT3 mRNA在不同时间点的显著变化。在0小时和其他时间点之间SIRT3 mRNA的显著变化通过随后的非配对分析t吨测试，*，对< 0.05; #,对> 0.05.
图4。
图4。
SIRT1、RELB和SIRT3调节线粒体生物能量学。为了测试不同的功能，用对照或基因特异性慢病毒shRNA感染THP-1细胞，使SIRT1、RELB或SIRT3基因稳定沉默。然后用1μg/ml的LPS刺激细胞达到指定的时间。A、，线粒体质量的变化由MitoTracker绿色染料在0、4、8和24小时的平均荧光强度定义。B线粒体团经MitoTracker Green染色的荧光显微镜研究。C、，OCR控制变更与在0和24小时评估基因特异性shRNA细胞。D类XF-24细胞外通量分析仪测定的基因沉默对生物能量学的影响。E类，乙酰化IDH2和SOD2在0和24小时使用抗乙酰化赖氨酸抗体测定(左侧面板)Ac-IDH的密度测定2和Ac-SOD2针对总免疫沉淀蛋白进行标准化(右侧面板).F类，线粒体超氧化物O2⨪使用Mito-Sox染料通过流式细胞术测定产量。G、，草地2生物化学评估的活性在体外中的数据一个显示为平均值±S.E(n个= 3). 中的数据C,D类,F类、和G公司是三口井的平均值±S.E.（代表n个= 3). 两个的代表性实验如所示B和E类.单向方差分析对中的值一个确定每个RNAi时间点的重要性；未配对的结果t吨测试如所示C,F类、和G公司中等浓度和LPS处理之间的AUCD类通过XF软件进行分析。*，对< 0.05; ***,对<0.001；#，对> 0.05.CTRL键：控件。
图5。
图5。
SIRT1、RELB和SIRT3顺序控制线粒体生物能量学。用1μg/ml的脂多糖刺激THP-1细胞24小时，分别减少和不减少单个RNAi。A中，Western blot测定稳定的击倒效率。B、，通过定量PCR分析基因沉默对3个基因mRNA表达的影响。LPS诱导的mRNASIRT1公司,RELB公司、和SIRT3号机组对照组敲除细胞；减少SIRT1公司减弱LPS诱导的mRNARELB公司和SIRT3号机组; 减少RELB公司最小化LPS诱导的SIRT3，但不SIRT1公司mRNA；减少SIRT3号机组对LPS诱导的SIRT1公司和RELB公司信使核糖核酸。C、，基因沉默对LPS诱导SIRT1、RELB、SIRT3、IDH的影响2和VDAC蛋白。D、，LPS诱导的OCR中SIRT1或RELB缺陷的补偿随着相反基因的过度表达而改变。RELB公司击倒SIRT1公司OCR中KD减少，但SIRT1公司敲入对RELB公司OCR的KD减少。插入显示了敲入效率。中的数据B和D类显示为平均值±S.E(n个= 3). 三个实验之一如所示C.单向方差分析对值如所示B和D类.随后未成对t吨中的分析B(*,对< 0.05; **,对<0.01）表明对照KD细胞中培养液和LPS处理之间mRNA变化的显著性，（∧，对< 0.05; ∧,对< 0.01; 三∧，对<0.001）比较每个基因特异性沉默细胞中LPS诱导的mRNA与对照RNAi中的mRNA。t吨中的测试D类比较其他组的OCR与基础OCR，***，对<0.001；#，对> 0.05.医学，中等；杜兰特，击倒；KI公司，敲门。
图6。
图6。
早期适应期间SIRT1抑制逆转生物能量学修饰。用1μg/ml LPS处理THP-1细胞24小时米LPS后8小时的EX-527。A、，EX-527抑制SIRT1可逆转LPS介导的OCR和SRC修饰。插入显示了实验设计。B、，EX-527抑制SIRT1影响RELB公司,SIRT3号机组,印尼盾2,VDAC公司、和草地2通过RT-PCR进行分析。数据显示为五个单独实验的平均值±S.E。C、，EX-527抑制SIRT1对RELB、SIRT3、IDH水平的影响2VDAC和SOD2。三个实验之一如所示一个和C处理和培养基之间的AUC一个用XF软件进行了分析。未付款t吨试验比较了LPS和LPS+EX-527处理在B, *,对< 0.05; **,对< 0.01; ***,对< 0.001.
图7。
图7。
SIRT1、RELB和SIRT3调节正常和脓毒症适应单核细胞的线粒体生物能量学。 A、，mRNA表达的改变SIRT1公司,RELB公司,SIRT3号机组,印尼盾2,草地2、和VDAC公司在通过阴性选择纯化的正常人单核细胞中，用100 ng/ml的LPS刺激0、8和24小时。数据显示为四个实验的平均值±S.E。B，在LPS后8 h给予EX-527抑制SIRT1对24 h正常初级单核细胞LPS诱导的mRNA表达的影响。数据显示为平均值±S.E(n个= 3).C、，LPS刺激的初级单核细胞在0到24小时之间的线粒体生物能量学变化，并在LPS后8小时添加EX-527 SIRT1抑制剂逆转（四个实验的代表性）。D、 TNF公司-健康和脓毒症单核细胞对100 ng/ml LPS刺激的α表达。数据显示为平均值±标准偏差(n个= 5).E、，经SIRT1抑制剂EX-527处理或未处理16h的适应型（耐LPS）人类脓毒症单核细胞中的mRNA表达。未处理脓毒症的单核细胞的反应设为1。数据显示为平均值±S.E(n个= 5).F、，EX-527 SIRT1抑制剂对经SIRT1抑制物EX-527处理16小时的适应型脓毒症单核细胞线粒体生物能量学变化的影响。单向方差分析对各个时间点的单个基因表达值如一个以及随后的未成对t吨测试确定了0h和其他时间点的显著性。未付款对值（*，对< 0.05; **,对<0.01）如所示B,D类、和E类.AUC统计信息如所示C和F类, *,对< 0.05; ***,对<0.001，与介质相比。
图8。
图8。
Sirt1、Relb和Sirt3调节正常和脓毒症适应小鼠脾细胞的线粒体生物能量学。 A–C，从C57/BL6小鼠中分离出正常脾细胞，并用100 ng/ml LPS刺激指定时间。从五家公司收集的数据(一个和B)或三个(C)展示了动物。A、，mRNA水平Sirt1（信号1）,Relb公司,苏尔特3,伊德2,草地2、和Vdac公司LPS刺激后0、8和24小时。B、，LPS后8 h添加EX-527抑制SIRT1对LPS诱导的脾细胞mRNA表达变化的影响。C、，在LPS刺激后8小时添加EX-527 Sirt1抑制剂处理或未处理的正常脾细胞的基础OCR变化，并在24小时评估。D、，mRNA变化Relb公司,苏尔特3,伊德2,草皮2、和Vdac公司CLP后24小时用载体二甲基亚砜或EX-527处理的小鼠分离的脓毒症脾细胞体外36小时（EX-527治疗后12小时）。三只动物的数据显示为平均值±S.E。E类，用Sirt1抑制剂EX-527处理脓毒症脾细胞16小时后，EX-527抑制剂对OCR的影响。误差线表示四口井的平均值±S.E。数据显示为三只动物的平均值±S.E。F、，CLP诱导脓毒症后野生型和SIRT3基因敲除129分钟的存活曲线（每组7只动物）。G公司，方案显示了SIRT1-RELB-SIRT3在适应急性炎症反应期间调节核-线粒体通讯和重塑线粒体生物能量学的顺序作用。单因素方差分析对跨时间点的基因值如所示一个.随后未成对t吨测试（*，对< 0.05; **,对<0.01）描述了与0小时相比基因表达的显著变化t吨测试对中显示的值B–E类比较EX-527处理细胞和未处理细胞之间的差异。对数秩（Mantel-Cox）检验对中的值F类比较野生型和Sirt3基因敲除129只小鼠的存活率。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Medzhitov R.（2010）《2010年的炎症：旧火焰的新冒险》。手机140、771–776-公共医学
    1. McCall C.E.、Yoza B.、Liu T.、El Gazzar M.（2010）全身炎症严重感染中的基因特异性表观遗传调控。J.先天免疫。2, 395–405-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Boomer J.S.、To K.、Chang K.C.、Takasu O.、Osborne D.F.、Walton A.H.、Bricker T.L.、Jarman S.D.、2nd、Kreisel D.、Krupnick A.S.、Srivastava A.、Swanson P.E.、Green J.M.、Hotchkiss R.S.（2011年）死于败血症和多器官衰竭患者的免疫抑制。JAMA雅玛3062594–2605-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Belikoff B.G.、Hatfield S.、Georgiev P.、Ohta A.、Lukashev D.、Buras J.A.、Remick D.G.、Sitkovsky M.（2011）A2B腺苷受体阻断增强巨噬细胞介导的细菌吞噬作用，并提高小鼠多微生物败血症的存活率。免疫学杂志。1862444–2453-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Hotchkiss R.S.，Karl I.E.（2003）《脓毒症的病理生理学和治疗》。北英格兰。《医学杂志》348，138-150-公共医学

出版物类型

MeSH术语