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.2014年10月30日4:4:6835。
doi:10.1038/srep06835。

α-catenin缺失引起胆汁淤积反应并损害肝脏再生

凯拉·乔安·赫尔 1, Ying-hung Nicole Tsang 1, 乔安娜·魏恩翁 1, 李秋实 2, 赖来雅 1, 魏妙玉 1, 郝茵 三, 罗马字母L Bogorad 三, 詹姆斯·达尔曼 4, Yee Gek Chan先生 5, 文华湾 5, Roshni Singaraja公司 6, 丹尼尔·安德森 7, 维克托·科特利安斯基 8, 维吉尔·维亚斯诺夫 2, 让·保罗·蒂里 9
附属公司

α-catenin缺失引起胆汁淤积反应并损害肝脏再生

凯拉·乔安·赫尔等。 科学代表. .

摘要

肝脏在损伤后具有独特的再生能力，在此过程中，肝细胞通过细胞粘附复合体积极分裂并建立细胞间接触。在这里，我们证明α-连环蛋白（一种公认的粘附成分）的丢失会显著破坏肝脏再生。使用部分肝切除模型，我们发现α-catenin击倒小鼠的再生肝明显大于对照再生肝，细胞大小和增殖增加。这种增殖增加与YAP激活增加相关，这与Hippo/YAP途径中的α-catenin有关。此外，α-catenin敲除小鼠表现出类似临床胆汁淤积症的表型，胆小管急剧改变，胆汁成分水平升高，并有黄疸和炎症迹象。再生能力受损是肌动蛋白细胞骨架结构紊乱的结果，导致顶端微绒毛丧失，胆管内腔扩张，以及紧密连接处漏水。这项研究阐明了α-连环蛋白在肝脏再生中的一种新的重要作用。

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数字

图1
图1。肝脏中α-连环蛋白的特异性敲除导致肝功能单位发生重大改变。
（A） 注射α-catenin siRNA-类固醇颗粒（LNP）的小鼠在肝脏中的α-catentin转录水平（每组n=6）表现出特定的下调，但在肾脏中没有（每组n=4）。（B） 肝脏α-catenin蛋白水平相应下降（每组n=6）。所示凝胶图像经过裁剪，呈现简洁。（C） 用针对IV型胶原（红色；10倍和20倍）和闭塞带（ZO）-1（绿色；40倍放大）的抗体对再生的肝组织进行免疫标记。在α-catenin siRNA-处理的肝脏中，用IV型胶原标记的窦状突是曲折的、无组织的。ZO-1免疫标记的胆管排列在一个有组织的管状结构网络中，而在α-catenin-siRNA注射的肝脏中观察到该网络中断。BC的管腔也扩大了。（D） 收获后，对肝脏进行解剖和称重。α-catenin-siRNA注射的肝脏比对照肝脏大50%。（E） 用N-钙粘蛋白对肝切片细胞膜进行免疫标记（红色；20倍放大），结果显示α-catenin siRNA注射的肝脏中的一些细胞明显较大。（F） 对实验肝脏的细胞大小进行了统计分析。顶部：计算并显示了单元格的概率分布图。底部：计算了对照和α-连环蛋白siRNA细胞群体之间的差异，并用siRNA和对照群体之间的百分比变化表示。这表明，与对照肝脏相比，α-catenin siRNA注射的肝脏在大小细胞组分中的富集程度更高（对照组：n=8，α-cat:n=11）。比例尺，50 微米。
图2
图2。α-catenin击倒小鼠的血液化学显示体内胆汁淤积。
对采集肝脏时从小鼠身上采集的血液样本进行血液化学分析，并测量与肝功能相关的几种标志物。（A） α-catenin siRNA注射组的碱性磷酸酶（ALP）水平显著升高。高ALP水平在临床上与胆管功能障碍有关。与对照组相比，siRNA注射组的总胆红素（TBIL）含量也升高，这表明胆汁生成和流动障碍。α-catenin注射组的淀粉酶（AMY）水平也显著升高，这在临床上与胆汁流动中断有关（对照组：n=17，α-cat:n=21）。（B） α-catenin注射组的总胆汁酸（TBA）水平也升高，这表明血液中TBA的积累很高。（C） α-catenin注射组的高密度脂蛋白（HDL）水平显著降低，对应于胆汁转运受阻（con:n=9，α-cat:n=10）。（D） 注射siRNA的小鼠表现出显著更高的总白细胞（WBC），这表明存在炎症。此外，白细胞群中的不同亚群均显著升高，包括中性粒细胞（NE）和单核细胞（MO）、淋巴细胞（LY）和嗜酸性粒细胞（EO）。K/µl：千/微升血液（con:n=17，siRNA:n=21）。
图3
图3。肝脏大小的增加是由于YAP激活导致肝细胞增殖增加所致。
（A） 用抗Ki67抗体（绿色）和DAPI（蓝色）对肝切片的细胞核进行免疫标记。左：对照组和α-catenin敲除肝脏切片的代表性图像。比例尺，50 微米。右图：然后计算α-catenin敲除和对照肝脏中Ki67阳性细胞占所有核阳性细胞的百分比。与对照肝相比，α-catenin敲除的肝表现出更高的增殖水平（%）（分别为13.37%和2.1%）。（B） 对肝脏裂解物进行磷酸化（p）YAP和总（t）YAP的印迹，在α-catenin敲除的肝脏中磷酸化YAP与总YAP的比率（百分比）显著降低（每组n=9）。所示凝胶图像经过裁剪，代表了在相同实验条件下运行的凝胶。（C） 用抗YAP抗体（棕色）对肝切片的细胞核进行免疫标记。上图：对照组和α-catenin敲除肝脏切片的代表性图像。比例尺，50 微米。左下图：计算α-catenin敲除和对照肝脏的YAP阳性（+ve）细胞核百分比（每组n=7）。（D） 结缔组织生长因子（CTGF）是YAP的一个重要下游转录靶点，对其基因表达水平进行了评估。CTGF在α-钙蛋白敲除的肝脏中显著上调（对照组n=7，α-钙素组n=10）。
图4
图4。肌动蛋白细胞骨架紊乱引起的胆管破裂导致微绒毛丧失和胆管管腔扩张。
（A） 在α-catenin敲除的肝脏中测量了四种重要胆汁转运蛋白的实时表达，即多药耐药相关蛋白-2（Mrp2）、Mrp3、多药耐药基因-1（Mdr1，也称为P-糖蛋白多药转运蛋白（Pgp）或ABCB1）和Mdr2，并与对照肝脏进行了比较。未观察到任何蛋白质的显著变化。（B） 肝切片用鬼笔肽免疫标记，以染色F-肌动蛋白（绿色）和DAPI（蓝色），并通过共聚焦显微镜观察。代表性染色显示，在对照肝脏中，肌动蛋白微丝沿细胞外围排列，呈有组织的周膜模式，但在α-catenin敲除的肝脏中，微丝严重扭曲和畸形。比例尺，20 微米。（C-D）在α-catenin击倒和对照肝脏上进行的典型电子显微镜图像。（C） 如图所示，控制BC由充满微绒毛的管腔组成。引人注目的是，α-catenin击倒小鼠的BC内腔扩张增加，微绒毛严重缺乏。（D） 放大的插图（最下面一行）显示了密封BC的紧密连接。在对照肝脏中，紧密连接的标志是两层膜融合成一层特征性的深色单层膜。相比之下，α-catenin击倒的肝脏中BC侧的膜没有融合，紧密连接区域显示出两个分离的质膜。比例尺，0.2 微米。
图5
图5。α-catenin在肝脏再生的整个过程中都是必需的。
对注射α-catenin-siRNA-类固醇颗粒（LNP）的小鼠进行手术，并在手术后1、2、4、6天进行血液和肝脏分析。（A） α-catenin siRNA-LNP注射小鼠从第1天起总胆汁酸显著增加，第4天达到峰值。（B） 总胆红素水平（TBIL）从第1天开始相应增加，第4天再次达到峰值。（C） 手术后第1天，注射α-catenin-siRNA-LNP的小鼠胆道结构的ZO-1染色（绿色）被破坏，并持续到第6天。（D） 仅从第2天起，总肝体重比显著增加（除第6天外，每个时间点n=3；对照组n=2）。除第6天外，所有配对组的p值均显著（不显著）。比例尺，20 微米。（E） 用抗YAP抗体（棕色）对肝切片的细胞核进行免疫标记。然后计算每个时间点α-catenin击倒和对照肝脏的YAP阳性（+ve）细胞核百分比。在每个时间点测量到显著差异（p<0.05）。（F） 结缔组织生长因子（CTGF）的基因表达。从第2天起，CTGF显著上调。在每个时间点测量到显著差异（p<0.05）。
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