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。2014年10月17日；289(42):29285-96.
doi:10.1074/jbc。M114.563924。 Epub 2014年9月3日。

糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的易位是通透性转换的触发因素，它依赖于激酶活性，并通过与电压依赖性阴离子通道2（VDAC2）的相互作用介导

马莎亚·塔诺 1, Atsushi Kuno公司 2, 石川佐子 1, Takayuki Miki公司 1, Hidemichi Kouzu先生 1, 柳野俊之 1, Hiromichi Murase公司 1, Toshiyuki Tobisawa先生 1, 小泽真本 1, Yoshiyuki Horio公司 三, 三浦哲二 4
附属机构

糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的易位是通透性转换的触发因素，它依赖于激酶活性，并通过与电压依赖性阴离子通道2（VDAC2）的相互作用介导

马莎亚·塔诺等。 生物化学杂志。 。

摘要

糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）是氧化应激条件下线粒体通透性转换孔（mPTP）的主要正调控因子，是细胞死亡的主要触发因子。然而，细胞溶质GSK-3β转位到线粒体促进mPTP开放的机制尚不清楚。在这里，我们通过分析GSK-3β的定点突变对线粒体易位和蛋白质/蛋白质相互作用对氧化应激的影响来解决这个问题。用GFP标记的GSK-3β（WT）转染H9c2成心肌细胞，GSK-3是一种对抑制性磷酸化（S9A）不敏感的突变型GSK-3，或激酶缺乏型GSK-2β（K85R）。延时观察显示，与K85R相比，WT和S9A在氧化应激后更快地从胞浆转移到线粒体。H2O2使抗GSK-3β免疫沉淀物双向凝胶电泳上的9个斑点密度增加了3倍以上。MALDI-TOF/MS分析显示其中一个斑点含有电压依赖性阴离子通道2（VDAC2）。siRNA敲除VDAC2，而不是VDAC1或VDAC3，可减弱应激条件下GSK-3β的线粒体易位和mPTP开放。用丙氨酸取代GSK-3βN端结构域中的Lys-15而不是Arg-4或Arg-6时，GSK-3的线粒体易位也减弱。氧化应激诱导的GSK-3β线粒体易位与细胞死亡增加有关，细胞死亡被氯化锂（LiCl）抑制，氯化锂是GSK-3的抑制剂。这些结果表明，GSK-3β以激酶活性和VDAC2依赖的方式从胞浆转运到线粒体，其中GSK-3的N末端结构域可能起到线粒体靶向序列的作用。

关键词：糖原合酶激酶3（GSK-3）；线粒体通透性转换（MPT）；线粒体转运；坏死（坏死性死亡）；蛋白质相互作用；依赖电压的阴离子通道2。

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数字

图1。
图1。
氧化应激条件下GSK-3β激酶活性依赖性线粒体易位。 一个，通过延时观测获得的荧光图像。H9c2细胞转染GFP标记的GSK-3β（WT）、组成活性突变体GSK-3？（S9A）、激酶活性突变体GSK-3？？（K85R）或GFP单独转染（GFP对照），然后用MitoTracker Red染色2O（运行）2（10μmol/升）。B类，线粒体定量(米托)每个质粒的定位。与GFP信号重叠的MitoTracker染色面积表示为总MitoTracher染色面积的百分比。*，对< 0.05与用相同质粒转染细胞并用载体处理；†，对< 0.05与用WT转染并用载体处理的细胞；†，对< 0.05与转染WT并暴露于H的细胞2O（运行）2。C线粒体组分中总GSK-3β的代表性免疫印迹(水户)和细胞溶质部分(细胞). 禁止素和β-肌动蛋白分别用作线粒体和胞浆的标记物。三个单独的实验显示了类似的结果。D类GSK-3β与线粒体蛋白的相互作用。免疫印迹(IB公司)GSK-3β免疫共沉淀(IP（IP）)含亲环素D(CyD公司)和Rieske与GSK-3β共同免疫沉淀，有或无H暴露2O（运行）2（100μmol/升；4小时）。误差线代表S.E。
图2。
图2。
GSK-3β的活性与细胞死亡有关。在添加h后4 h，测量培养基中的LDH活性2O（运行）2（100μmol/升）-与基线值相比，LDH活性增加了一倍。*，对< 0.05与GFP对照。误差线代表S.E。
图3。
图3。
GSK-3β抑制对氧化应激产生ROS的影响。缺氧/复氧后活性氧的产生(一个)或暴露于50μmol/L抗霉素A(B类)DCF染色监测。氯化锂对GSK-3β有抑制作用。显示DCF染色的信号强度。*，对< 0.05与控制；†，对< 0.05与缺氧/复氧(H/R公司); ‡,对< 0.05与抗霉素A(AA公司).误差线代表S.E。美国。，任意单位。
图4。
图4。
H的影响2O（运行）2对GSK-3β活性及其与其他蛋白质的相互作用的影响。 一个，H9c2细胞暴露于100μmol/L H2O（运行）2或车辆(Ve（车辆）)4小时后收获。总匀浆中总GSK-3β、Ser-9-磷酸GSK-3α、Tyr-216-phospho-GSK-3γ、总糖原合成酶和磷酸糖原合酶的Western blotting结果(左侧面板)线粒体部分中的总GSK-3β和Ser-9-磷酸GSK-3(右侧面板)如图所示。β-肌动蛋白和抑制素用作负荷控制。B类考马斯蓝染色的代表性二维凝胶。样品取自H9c2细胞的GSK-3β免疫沉淀物，用载体或H处理202（100μmol/升）持续3小时。四次车用处理细胞实验和四次h实验的结果2O（运行）2-暴露细胞相似。暴露于H后密度增加3倍或更多的斑点2O（运行）2标记为1–9.C，转染FLAG-VDAC2的HEK293细胞暴露于H2O（运行）2（100μmol/升；4小时）。免疫印迹(IB公司)用于FLAG和GSK-3β免疫共沉淀(IP（IP）)带FLAG-VDAC2显示。
图5。
图5。
VDAC2依赖于GSK-3β的线粒体易位和线粒体产生超氧物。 一个和B类H9c2细胞中的mRNA水平(一个)和HEK293细胞中的蛋白质水平(B类)VDAC2 siRNA转染后48小时，对< 0.05与控制siRNA。CGFP标记的GSK-3β（WT）的线粒体定位，表达为基线以及暴露于H后1分钟和3分钟时GFP阳性线粒体在总线粒体中的百分比2O（运行）2在H9c2细胞中。*，对< 0.05与基线；†，对< 0.05与控制siRNA。D类用VDAC1 siRNA、VDAC2 siRNA或VDAC3 siRNA转染HEK293细胞(有丝分裂)在暴露于或不暴露于H的线粒体总数中2O（运行）2（10μmol/升；3分钟）。*，对< 0.05与基线；†，对< 0.05与VDAC2 siRNA。E类，VDAC2和GSK-3β激酶活性对超氧化物生成的影响。暴露于H后的超氧化物信号2O（运行）2在转染WT、S9A或K85R的H9c2细胞中显示。F类，显示了每个细胞超氧化物阳性像素的定量分析。*，对< 0.05与控制siRNA；†，对< 0.05与重量。误差线代表S.E。美国。，任意单位。
图6。
图6。
VDAC2敲低对线粒体变形、mPTP开放和氧化应激引起的细胞坏死的影响。 一个线粒体照片，通过超分辨率显微镜（N-SIM）延时观察获得。H9c2细胞转染对照siRNA或VDAC2 siRNA，然后用MitoTracker Red染色，然后用N-SIM观察。箭头间歇性激光扫描后显示线粒体肿胀，进行延时观察。B类，通过N-SIM观察4分钟后肿胀或破碎线粒体的百分比。*，对< 0.05与控制siRNA。C显示了线粒体部分BAK和BAX的免疫印迹。作为装载控制。清晰的禁止带和几乎检测不到的β-肌动蛋白带表明线粒体分离成功。D类，通过钙黄绿素分析测定HEK293细胞中mPTP的开闭状态。转染VDAC1 siRNA、VDAC2 siRNA或VDAC3 siRNA的钙黄绿素染色细胞的图像2O（运行）2和/或氯化锂如图所示。E类钙调素阳性面积与线粒体跟踪器阳性面积的比值是线粒体的一个指标(米托)未开放mPTPs。*，对< 0.05与基线（无H2O（运行）2和氯化锂）；†，对< 0.05与VDAC2 siRNA。F类，在添加h后4 h测量培养基中的LDH活性2O（运行）2（100μmol/升）-与基线值相比，LDH活性增加了一倍。G公司、转染GFP-GSK-3β构建物（WT、S9A或K85R）或GFP对照的H9c2细胞中GSK-3？的Western blotting。分别在46和79kDa左右检测到内源性GSK-3β和GFP标记的GSK-3β构建体。误差线代表S.E。
图7。
图7。
GSK-3βN端结构域突变对线粒体易位的影响。GFP阳性线粒体百分比(米托)在基线和H后1分钟和3分钟时线粒体总数中2O（运行）2显示曝光。*，对< 0.05与重量：†，对< 0.05与基线。误差线代表S.E。
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