Quantitative quadruple-label immunofluorescence of mitochondrial and cytoplasmic proteins in single neurons from human midbrain tissue

doi:10.1016/j.jneumeth.2014.05.026

.2014年7月30日；232(100):143-9.

doi:10.1016/j.jneumeth.2014.05.026。 Epub 2014年5月29日。

人中脑组织单个神经元线粒体和细胞质蛋白的定量四标记免疫荧光

安妮·格吕纽瓦尔德¹, Nichola Z Lax公司², 玛丽安娜·C·罗查^三, 艾米·K·里夫⁴, Philippa D Hepplewhite公司⁵, 卡罗琳娜·雷吉尔⁶, 罗伯特·泰勒⁷, 道格·M·特恩布尔⁸

附属公司

¹英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所Wellcome线粒体研究信托中心；德国吕贝克大学神经遗传学研究所。电子地址：anne.gruenewald@newcastle.ac.uk。
²英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所Wellcome线粒体研究信托中心。电子地址：nichola.lax@newcastle.ac.uk。
^三英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所Wellcome线粒体研究信托中心。电子地址：m.rocha@newcastle.ac.uk。
⁴英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所Wellcome线粒体研究信托中心。电子地址：amy.reeve@newcastle.ac.uk。
⁵英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所Wellcome线粒体研究信托中心。电子地址：philippa.hepplewhite@newcastle.ac.uk。
⁶英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所Wellcome线粒体研究信托中心。电子地址：karolina.rygiel@newcastle.ac.uk。
⁷英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所Wellcome线粒体研究信托中心。电子地址：Robert.taylor@newcastle.ac.uk。
⁸英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所Wellcome线粒体研究信托中心。电子地址：doug.turnbull@newcastle.ac.uk。

PMID： 24880043
预防性维修识别码：项目经理4076514
内政部： 2016年10月10日/j.jnumeth.2014.05.026

人中脑组织单个神经元线粒体和细胞质蛋白的定量四标记免疫荧光

安妮·格吕纽瓦尔德等。神经科学方法杂志. 2014.

.2014年7月30日；232(100):143-9.

doi:10.1016/j.jneumeth.2014.05.026。 Epub 2014年5月29日。

作者

安妮·格吕纽瓦尔德¹, Nichola Z Lax公司², 玛丽安娜·C·罗查^三, 艾米·里夫⁴, Philippa D Hepplewhite公司⁵, 卡罗琳娜·雷吉尔⁶, 罗伯特·泰勒⁷, 道格·M·特恩布尔⁸

附属公司

¹英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所Wellcome线粒体研究信托中心；德国吕贝克大学神经遗传学研究所。电子地址：anne.gruenewald@newcastle.ac.uk。
²英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所Wellcome线粒体研究信托中心。电子地址：nichola.lax@newcastle.ac.uk。
^三英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所Wellcome线粒体研究信托中心。电子地址：m.rocha@newcastle.ac.uk。
⁴英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所Wellcome线粒体研究信托中心。电子地址：amy.reeve@newcastle.ac.uk。
⁵英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所Wellcome线粒体研究信托中心。电子地址：philippa.hepplewhite@newcastle.ac.uk。
⁶英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所Wellcome线粒体研究信托中心。电子地址：karolina.rygiel@newcastle.ac.uk。
⁷英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所Wellcome线粒体研究信托中心。电子地址：Robert.taylor@newcastle.ac.uk。
⁸英国泰恩河畔纽卡斯尔大学老龄与健康研究所Wellcome线粒体研究信托中心。电子地址：doug.turnbull@newcastle.ac.uk。

PMID： 24880043
预防性维修识别码：项目经理4076514
内政部： 2016年10月10日/j.jnumeth.2014.05.026

摘要

背景：在原发性线粒体DNA疾病中发现呼吸链缺陷。局灶性RC缺陷也与衰老和神经退行性疾病有关，例如帕金森病患者的黑质（SN）神经元。在线粒体疾病和衰老中，不同神经元的线粒体DNA突变负荷差异很大，需要对RC缺陷进行单细胞评估。评估SN神经元中RC缺陷的全部程度是具有挑战性的，因为它们的大小阻碍了连续切片的研究。我们开发了一种使用四重免疫荧光检测单个SN神经元RC异常的方法。

新方法：使用针对复合物I（CI）和IV亚单位、孔蛋白和酪氨酸羟化酶的抗体以及IgG亚型特异性荧光标记的二级抗体，我们量化了CI和CIV的表达，并与多巴胺能神经元的线粒体质量进行了比较。相对于标准对照，测定CI：孔蛋白和CIV：孔蛋白比率。

结果：定量分析线粒体DNA疾病和已知RC缺陷患者中脑切片中复杂亚单位的表达，一致显示CI：孔蛋白和/或CIV：孔蛋白比率降低。

与现有方法的比较：研究线粒体功能障碍的标准组织化学方法，细胞色素c氧化酶/琥珀酸脱氢酶分析，测量CIV和CII活性。为了研究患者的CI，需要在其他部分进行免疫组织学检查，即在不同的神经元中。我们的方法允许在单个细胞水平上关联CI、CIV和线粒体质量的表达。

结论：定量四标记免疫荧光是测量单个神经元RC缺陷的可靠工具，这将有助于对遗传性和后天性线粒体功能障碍的分子机制有新的见解。

关键词：综合体I；综合体IV；免疫荧光标记；中脑神经元；线粒体；单细胞分析。

PubMed免责声明

数字

图1
年龄相关RC缺陷对照组连续骨骼肌切片中呼吸链复合体表达和酶活性的相关性。（a和b）用显色或荧光标记对CI-20和CIV-1进行免疫组织学检测。线粒体疾病患者个体肌纤维中CI-20或CIV-1的免疫反应性增加（#）或减少（*）可在连续切片中检测到，与所使用的可视化方法无关。（c）细胞色素*c（c）*氧化酶（COX）组织化学。COX活性与对照个体个体肌纤维中CIV-1的表达相对应，证实了两种不同技术之间的良好相关性。

图2
年龄匹配的对照组、线粒体疾病和PD患者多巴胺能中脑神经元中复合物I-20、复合物IV-1、孔蛋白和酪氨酸羟化酶（TH）的荧光标记免疫组织学研究。所用四个荧光通道的表观荧光显微镜图像（发射波长：405 nm、488 nm、546 nm和647 nm）在不同的中脑研究切片中，曝光时间保持不变。图像显示了患者和对照组之间呼吸链酶亚单位和线粒体质量的蛋白质表达差异。考虑到孔蛋白水平，单个大规模mtDNA缺失患者表现出孤立的CI缺乏，而m.8344A>G MERRF和PD患者表现出CI和CIV的联合表达缺失。TH阳性染色和神经黑色素沉着（亮场通道中的暗区）表明所研究神经元的多巴胺能特性。TH阳性神经元的轮廓显示在所有通道中。MERRF–肌阵挛性癫痫和破伤风红纤维病，PD–帕金森病，Sng-del–单一大规模线粒体DNA缺失。

图3
对来自一名对照个体和线粒体疾病或PD患者的多巴胺能中脑神经元中复合物I-20和复合物IV-1表达的密度分析。连续实验的数据显示在左侧面板中，每个人的综合结果显示在右侧面板中。（a和b）单个神经元的CI-20和CIV-1蛋白水平相对于线粒体质量标记物孔蛋白表达。该分析一致表明，与对照神经元相比，单个大规模线粒体DNA缺失患者神经元的CI-20蛋白水平低于CIV-1。相比之下，一名m.8344A>G MERRF患者在所有分析的中脑切片中均表现出CI和CIV表达的联合缺失。类似地，在帕金森病患者中，在所有个体试验中都检测到CI-20和CIV-1水平降低。（c） CI-20与CIV-1比值的计算表明，仅在单个大规模线粒体DNA缺失患者的神经元中，CI缺乏明显改变。测定了每节50-100个神经元的蛋白质水平，并分析了四个独立实验运行中每个个体的四个节段。酪氨酸羟化酶（TH）染色鉴定多巴胺能神经元。在每次运行中，将控制率设置为100%，作为内部标准。点表示每个单元格的比率，每个数据集的中值标记为一条线。MERRF–肌阵挛性癫痫和破伤风红纤维病，PD–帕金森病，Sng-del–单一大规模线粒体DNA缺失*第页 < 0.05; ***第页 < 0.001.

请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

呼吸链缺陷型帕金森病神经元线粒体DNA耗竭。
Grünewald A、Rygiel KA、Hepplewhite PD、Morris CM、Picard M、Turnbull DM。 Grünewald A等人。 Ann Neurol公司。2016年3月；79(3):366-78. doi:10.1002/ana.24571。Epub 2016年1月28日。 Ann Neurol公司。2016 PMID：26605748 免费PMC文章。
利用死后人体组织研究单个黑质神经元线粒体生物发生缺陷。
Chen C、Vincent AE、Blain AP、Smith AL、Turnbull DM、Reeve AK。 Chen C等。神经生物学疾病。2020年2月；134:104631. doi:10.1016/j.nbd.2019.104631。Epub 2019年11月2日。神经生物学疾病。2020 PMID：31689514
致病性线粒体DNA突变对黑质神经元的影响。
Reeve A、Meagher M、Lax N、Simcox E、Hepplewhite P、Jaros E、Turnbull D。 Reeve A等人。神经科学杂志。2013年6月26日；33(26):10790-801. doi:10.1523/JNEUROSCI.3525-12.2013。神经科学杂志。2013 PMID：23804100 免费PMC文章。
泛醌（辅酶q10）和线粒体在帕金森病氧化应激中的作用。
Ebadi M、Govitrapong P、Sharma S、Muralikrishnan D、Shavali S、Pellett L、Schafer R、Albano C、Eken J。 Ebadi M等人。生物信号接收。2001年5月至8月；10(3-4):224-53. doi:10.1159/000046889。生物信号受体。2001 PMID：11351130 审查。
线粒体基因组对阿尔茨海默病线粒体功能障碍的影响。
Onyango一世、Khan S、Miller B、Swerdlow R、Trimmer P、Bennett P Jr。 Onyango I等人。阿尔茨海默病杂志。2006年7月；9(2):183-93. doi:10.3233/jad-2006-9210。阿尔茨海默病杂志。2006 PMID：16873965 审查。

查看所有类似文章

引用人

线粒体生物能量学和多巴胺激动剂的相互作用是帕金森病的有效疾病调节治疗。
Neha、Mazahir I、Khan SA、Kaushik P、Parvez S。 Neha等人。摩尔神经生物学。2024年3月11日。doi:10.1007/s12035-024-04078-8。打印前在线。摩尔神经生物学。2024 PMID：38468113 审查。
细胞色素c（c）用扫描电化学显微镜检测人成纤维细胞中的氧化酶缺乏。
Thind S、Lima D、Booy E、Trinh D、McKenna SA、Kuss S。 Thind S等人。美国国家科学院院刊2024年1月2日；121（1）：e2310288120。doi:10.1073/pnas.2310288120。Epub 2023年12月28日。美国国家科学院院刊，2024年。 PMID：38154062
阻力运动训练挽救1型强直性肌营养不良患者骨骼肌线粒体功能障碍。
Di Leo V、Lawless C、Roussel议员、Gomes TB、Gorman GS、Russell OM、Tuppen HAL、Duchesne E、Vincent AE。 Di Leo V等人。神经肌肉疾病杂志。2023;10(6):1111-1126. doi:10.3233/JND-230099。神经肌肉疾病杂志。2023 PMID：37638448 免费PMC文章。
CYB5R3过度表达可保护老龄转基因小鼠的骨骼肌线粒体和自噬信号。
López-Bellón S、Rodríguez-López S、González-Reyes JA、Burón MI、de Cabo R、Villalba JM。 López-Bellón S等人。古生物学。2022年8月；44(4):2223-2241. doi:10.1007/s11357-022-00574-8。Epub 2022年5月9日。古生物学。2022 PMID：35527283 免费PMC文章。
人类中脑的单细胞测序揭示了胶质细胞激活和帕金森特异性神经元状态。
SmajićS、Prada-Medina CA、Landoulsi Z、Ghelfi J、Delcambre S、Dietrich C、Jarazo J、Henck J、Balachandran S、Pachchek S、Morris CM、Antony P、Timmermann B、Sauer S、Pereira SL、Schwamborn JC、May P、Grünewald A、Spielmann M。 SmajićS等人。大脑。2022年4月29日；145(3):964-978. doi:10.1093/brain/awab446。大脑。2022 PMID：34919646 免费PMC文章。

查看所有“被引用”文章

工具书类

1. Bender A.、Krishnan K.J.、Morris C.M.、Taylor G.A.、Reeve A.K.、Perry R.H.老年和帕金森病患者黑质神经元线粒体DNA高水平缺失。自然遗传学。2006;38:515–517.-公共医学
1. Billinton N.，Knight A.W.通过树木观察木材：区分绿色荧光蛋白和内源性自体荧光的技术综述。Anal生物化学。2001;291:175–197.-公共医学
1. Blachly-Dyson E.、Baldini A.、Litt M.、McCabe E.R.、Forte M.编码线粒体外膜电压依赖性阴离子通道（VDAC）的人类基因：两种新亚型的定位和鉴定。基因组学。1994;20:62–67.-公共医学
1. Campbell G.R.、Reeve A.K.、Ziabreva I.、Reynolds R.、Turnbull D.M.、Mahad D.J.进行性多发性硬化症患者肌肉内线粒体DNA缺失不过量。穆特·斯克勒。2013年；19:1858–1866.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Colombini M.位于线粒体外膜的电压依赖性阴离子选择性通道（VDAC）的结构和作用模式。美国科学院。1980;341:552–563.-公共医学

出版物类型

行动

MeSH术语

行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动

物质

行动
行动
行动
行动

赠款和资金

LinkOut-更多资源

[1] Bender A.、Krishnan K.J.、Morris C.M.、Taylor G.A.、Reeve A.K.、Perry R.H.老年和帕金森病患者黑质神经元线粒体DNA高水平缺失。自然遗传学。2006;38:515–517.-公共医学

[2] Bender A.、Krishnan K.J.、Morris C.M.、Taylor G.A.、Reeve A.K.、Perry R.H.老年和帕金森病患者黑质神经元线粒体DNA高水平缺失。自然遗传学。2006;38:515–517.-公共医学

[3] Billinton N.，Knight A.W.通过树木观察木材：区分绿色荧光蛋白和内源性自体荧光的技术综述。Anal生物化学。2001;291:175–197.-公共医学

[4] Billinton N.，Knight A.W.通过树木观察木材：区分绿色荧光蛋白和内源性自体荧光的技术综述。Anal生物化学。2001;291:175–197.-公共医学

[5] Blachly-Dyson E.、Baldini A.、Litt M.、McCabe E.R.、Forte M.编码线粒体外膜电压依赖性阴离子通道（VDAC）的人类基因：两种新亚型的定位和鉴定。基因组学。1994;20:62–67.-公共医学

[6] Blachly-Dyson E.、Baldini A.、Litt M.、McCabe E.R.、Forte M.编码线粒体外膜电压依赖性阴离子通道（VDAC）的人类基因：两种新亚型的定位和鉴定。基因组学。1994;20:62–67.-公共医学

[7] Campbell G.R.、Reeve A.K.、Ziabreva I.、Reynolds R.、Turnbull D.M.、Mahad D.J.进行性多发性硬化症患者肌肉内线粒体DNA缺失不过量。穆特·斯克勒。2013年；19:1858–1866.-项目管理咨询公司-公共医学

[8] Campbell G.R.、Reeve A.K.、Ziabreva I.、Reynolds R.、Turnbull D.M.、Mahad D.J.进行性多发性硬化症患者肌肉内线粒体DNA缺失不过量。穆特·斯克勒。2013年；19:1858–1866.-项目管理咨询公司-公共医学

[9] Colombini M.位于线粒体外膜的电压依赖性阴离子选择性通道（VDAC）的结构和作用模式。美国科学院。1980;341:552–563.-公共医学

[10] Colombini M.位于线粒体外膜的电压依赖性阴离子选择性通道（VDAC）的结构和作用模式。美国科学院。1980;341:552–563.-公共医学

将引文保存到文件

电子邮件引文

添加到集合

添加到我的书目

您保存的搜索

为外部引文管理软件创建文件

您的RSS源

人中脑组织单个神经元线粒体和细胞质蛋白的定量四标记免疫荧光

附属公司

人中脑组织单个神经元线粒体和细胞质蛋白的定量四标记免疫荧光

作者

附属公司

摘要

数字

类似文章

引用人

工具书类

出版物类型

MeSH术语

物质

赠款和资金

LinkOut-更多资源

全文源

其他文献来源

医疗

摘要

数字

类似文章

引用人

工具书类

出版物类型

MeSH术语

物质

相关信息

赠款和资金

LinkOut-更多资源

全文源

其他文献来源

医疗