PADI4 acts as a coactivator of Tal1 by counteracting repressive histone arginine methylation

doi:10.1038/ncomms4995

.2014年5月29日:5:3995。

doi:10.1038/ncomms4995。

PADI4通过对抗抑制性组蛋白精氨酸甲基化而充当Tal1的辅激活剂

附属公司

¹Georg-Speyer-Haus，肿瘤生物学和实验治疗研究所，德国法兰克福，邮编：D-60596，Paul-Ehrlich-Strasse 42-44。
²德国梅因河畔法兰克福市西奥多·斯特恩·凯7号约翰·沃尔夫冈·戈特大学血液学/肿瘤学医学系，邮编：D-60590。
^三1] Georg-Speyer-Haus，肿瘤生物学和实验治疗研究所，Paul-Ehrlich-Strasse 42-44，D-60596 Frankfurt am Main，Germany[2]。
⁴德国法兰克福Max-von-Laue-Strasse 9，D-60438，Johann-Wolfgang-Goethe大学药物化学研究所。
⁵戈廷根医科大学转录组分析实验室，Justus-von-Liebig-Weg 11，D-37077 Goettingen，德国。
⁶德国红十字会血液服务和输血医学与免疫血液学研究所，约翰·沃尔夫冈·戈特大学，德国法兰克福D-60528 Sandhofstrasse 1号。
⁷1] 约翰·沃尔夫冈·戈特大学血液学/肿瘤学医学系，德国法兰克福市西奥多·斯特恩·凯7号，邮编：D-60590[2]德国癌症联合会（DKTK），德国海德堡。
⁸1] 约翰·沃尔夫冈·歌德大学药物化学研究所，Max von Laue Strasse 9，D-60438 Frankfurt am Main，Germany[2]德国癌症联合会（DKTK），德国海德堡。

PMID： 24874575
PMCID公司：下午405257
内政部： 10.1038/ncomms4995

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PADI4通过对抗抑制性组蛋白精氨酸甲基化而充当Tal1的辅激活剂

斯蒂芬·科洛齐（Stephan Kolodziej）等。国家公社. 2014.

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.2014年5月29日：5:3995。

doi:10.1038/ncomms4995。

附属公司

¹Georg-Speyer-Haus，肿瘤生物学和实验治疗研究所，德国法兰克福，邮编：D-60596，Paul-Ehrlich-Strasse 42-44。
²德国梅因河畔法兰克福市西奥多·斯特恩·凯7号约翰·沃尔夫冈·戈特大学血液学/肿瘤学医学系，邮编：D-60590。
^三1] Georg-Speyer-Haus，肿瘤生物学和实验治疗研究所，Paul-Ehrlich-Strasse 42-44，D-60596 Frankfurt am Main，Germany[2]。
⁴德国法兰克福Max-von-Laue-Strasse 9，D-60438，Johann-Wolfgang-Goethe大学药物化学研究所。
⁵德国哥廷根医科大学，Justus von Liebig Weg 11，D-37077转录组分析实验室。
⁶德国红十字会血液服务和输血医学与免疫血液学研究所，约翰·沃尔夫冈·戈特大学，德国法兰克福D-60528 Sandhofstrasse 1号。
⁷1] 约翰·沃尔夫冈·歌德大学医学系，血液学/肿瘤学，Theodor Stern Kai 7，D-60590德国法兰克福[2]德国癌症联合会（DKTK），德国海德堡。
⁸1] 约翰沃尔夫冈·戈特大学药物化学研究所，Max-von-Laue-Strasse 9，D-60438 Frankfurt am Main，Germany[2]德国癌症联合会（DKTK），德国海德堡。

PMID： 24874575
PMCID公司：项目经理4050257
内政部： 10.1038/ncomms4995

摘要

转录因子Tal1是造血和白血病中基因表达的关键激活物或抑制物。Tal1差异影响不同基因转录的机制尚不完全清楚。这里我们显示Tal1与肽基精氨酸脱氨酶IV（PADI4）相互作用。我们证明PADI4可以通过影响H3R2me2a发挥表观遗传辅活化因子的作用。在Tal1/PADI4靶基因IL6ST处，由PRMT6触发的抑制性H3R2me2a标记被PADI4抵消，PADI4增强活性H3K4me3标记，从而增加IL6ST的表达。相反，在CTCF启动子PADI4起到阻遏作用。我们认为，PADI4对IL6ST转录的影响在造血干/祖细胞系分化过程中IL6ST表达的控制中起到了作用。这些结果为白血病中Tal1的药理作用提供了可能性。

PubMed免责声明

数字

**图1。PADI4是一个新型Tal1交互伙伴。**
(一)通过亲和力鉴定Tal1相互作用组的成员纯化和基于SILAC的MS分析。显示富集的蛋白质重（H）-轻（L）标记肽5以上（H/L>5）在基于SILAC的MS分析中确定为Tal1相互作用组分标记为灰色、黄色（Tal1）和蓝色（PADI4）。进一步不显著的浓缩蛋白质图中显示了五倍至2.5倍的H/L比率。详细信息包括所有已识别和量化的蛋白质的总数在补充数据1中。(b条)内源性Tal1与HEL细胞中的内源性PADI4相互作用。使用抗Tal1抗体进行免疫沉淀（IP），共免疫沉淀检测到（CoIP）PADI4带有抗PADI4抗体。(**c（c）**)塔尔1在中与PADI4交互用转染HEK293细胞的裂解物进行CoIP。已执行IP带有防旗M2珠，可拉出Flag-Tal1。用抗HA检测到免疫沉淀的HA标记的PADI4抗体。(d日,**e（电子）**)体外翻译后的PADI4与GST-塔尔1和*在里面体外*翻译后的Tal1在GST下拉中与GST-PADI4交互。(**（f）**)GST-下拉中Tal1的C末端与PADI4的相互作用。(克)C的相互作用PADI4终点Tal1的C终点GST下拉。(小时)相互作用的示意图Tal1和PADI4给出了蛋白质的大致位置。

**图2。Tal1和PADI4基因敲除后的基因表达分析。**
(一)用shRNAs转导HEL细胞对抗PADI4（shPADI4）和敲除通过定量实时PCR进行评估。误差条表示时间的s.d从两个独立的转导物中进行至少四次测定。(b条)HEL公司用抗Tal1（shTal1）的shRNAs转导细胞并敲除通过定量实时PCR进行评估。误差条表示时间的s.d从两个独立的转导物中进行至少四次测定。(**c（c）**)用shTal1和shPADI4细胞进行基因表达阵列分析。Tal1击倒发生改变1203个基因的表达和PADI4的敲除改变了702的表达基因。(d日)Tal1-和PADI4影响基因的比较。基因（414）在两者中都发生了变化数据集。(**e（电子）**)414个变更基因的基因本体分析Tal1和PADI4击倒。这个饼图给出了数字最高的富集GO-项（GO-项-BP）包含的基因。使用标准的DAVID进行分析设置。*P（P）*-给出了值。

**图3。Tal1和PADI4基因敲除后基因表达变化的验证。**
(一–**（f）**)阵列分析中的基因子集是通过定量实时PCR重新分析。误差条表示来自至少四次决定和两次独立击倒。

图4。**Tal1和PADI4与** **IL6ST（IL6ST）** **Tal1的5′-区及其影响。**
(一)被分析对象的示意图*IL6ST（IL6ST）*基因组位点包括5′-区。给出了基因组位置指出了用于ChIP分析的引物对的位置。第一个非编码外显子标记为深绿色，第一内含子标记为浅绿色。(b条)Tal1绑定到的映射*IL6ST（IL6ST）*5′-区。在ChIP上使用Tal1抗体qPCR和不同位置的引物IL6ST的5′-区。(**c（c）**)ChIP显示绑定PADI4至*IL6ST（IL6ST）*5′-区。在ChIP上使用抗PADI4抗体qPCR和引物对IL6ST 5′-区进行不同位置的定位。这个*P（P）*-值给出了与底漆A相比，底漆E收集的值。(d日–**（f）**)Tal1和PADI4与*IL6ST（IL6ST）*通过ChIP-ReChIP检测5′-区。(d日)在靠近第一外显子的区域*IL6ST（IL6ST）*（底漆E）。(**e（电子）**)上游未检测到Tal1/PADI4底漆（底漆A）。(**（f）**)ChIP-ReChIP qPCR产物的分析qPCR反应终点的凝胶电泳证实了qPCR结果。给出了抗体组合和引物对。这个*P（P）*-价值(**P（P）*<0.05）给出了统计显著性根据学生的t吨-测试。(克)ChIP显示下降Tal1绑定到*IL6ST（IL6ST）*Tal1上的启动子击倒。(小时)ChIP显示PADI4与*IL6ST（IL6ST）*Tal1上的启动子击倒。(我)组蛋白修饰标记H3K9ac和H3K4me3是Tal1减少IL6ST击倒发起人。(j个)组蛋白修饰H3R2me2a保持在低水平Tal1击倒时的等级IL6ST启动子处H3R17me2a增加。(k个)PRMT6和PRMT4结合减少Tal1在IL6ST启动子。数值显示为与输入相比的浓缩百分比。误差线代表至少四次测定的标准偏差。这个*P（P）*-值使用t吨-测试**P（P）*<0.05,***P（P）*<0.01.

图5。**PADI4基因敲除后的表观遗传学变化** **CTCF公司** 和 **il6吨** **发起人。**
(一)ChIP显示PADI4占用率下降*CTCF公司*和*IL6ST（IL6ST）*发起人PADI4击倒。(b条)ChIP显示Tal1与*CTCF公司*和*IL6ST（IL6ST）*发起人PADI4击倒。(**c（c）**)PRMT4介导的H3R17me2a标记在PADI4击倒这个*CTCF公司*和*IL6ST（IL6ST）*发起人。(d日)PRMT4绑定在*CTCF公司*和*IL6ST（IL6ST）*发起人PADI4击倒。(**e（电子）**)H3R2me2a在PADI4击倒后增加*IL6ST（IL6ST）*发起人，但不在*CTCF公司*发起人。(**（f）**)PRMT6绑定在*IL6ST（IL6ST）*PADI4启动子击倒。(克)H3K4me3组蛋白标记在这个*IL6ST（IL6ST）*发起人。(小时)阳性组蛋白标记H3K9ac在PADI4击倒这个*IL6ST（IL6ST）*发起人。数值显示为与输入相比的浓缩百分比。误差条表示至少四次测定的s.d。这个*P（P）*-使用t吨-测试，**P（P）*<0.05, ***P（P）*<0.01, ****P（P）*<0.001. NS、，不显著。

图6。**PADI4抑制剂Cl-脒影响** **IL6ST（IL6ST）** **基因表达和表观遗传标记。**
(一)*IL6ST（IL6ST）*用Cl-amidine处理HEL细胞后表达降低(200 μM）用于48 小时(b条)Tal1入住率*IL6ST（IL6ST）*氯脒启动子用ChIP测定HEL细胞的处理。(**c（c）**)PADI4占用*IL6ST（IL6ST）*氯脒启动子用ChIP测定HEL细胞的处理。(d日)阴性组蛋白标记H3R2me2a在*IL6ST（IL6ST）*氯脒处理HEL细胞的启动子由ChIP测量。(**e（电子）**)H3K4me3在*IL6ST（IL6ST）*发起人氯脒处理HEL细胞中。(**（f）**)H3R17me2a位于*IL6ST（IL6ST）*发起人是不受氯脒影响治疗。(克,小时)相比之下*IL6ST（IL6ST）*发起人，在*CTCF公司*启动子H3R17me2a增加，H3R2me2a保持不变Cl脒处理。数值显示为与输入相比的浓缩百分比。误差线表示至少四次测定的标准偏差。这个*P（P）*-值为使用t吨-测试**P（P）*<0.05,***P（P）*<0.01, ****P（P）*<0.001. NS，不显著。

图7。**IL6ST（IL6ST）** **表达式更改** **在与PADI4募集和表观遗传改变相关的hCD34+细胞分化过程中。**
(一)*IL6ST（IL6ST）*在红系和单核细胞分化后表达增加原代人CD34+细胞巨核细胞分化后保持不变。(b条)Tal1绑定到*IL6ST（IL6ST）*启动子在红系和巨核细胞分化时不变。(**c（c）**)PADI4型绑定到*IL6ST（IL6ST）*促进剂在红系和单核细胞分化，巨核细胞分化后减少。(d日)抑制性H3R2me2a标记在红系和单核细胞的巨核细胞分化和减少区别。使用至少两个独立的准备并测量两份。值被标准化为输入和作为背景的相对富集。(**e（电子）**)的影响PADI4开造血集落形成。PADI4的过度表达减少了CFU-C测定中的单核细胞集落。酶失活的PADI4突变体不抑制单核细胞分化。(**（f）**)敲下PADI4会增加集落形成单元C分析中的单核细胞集落。hCD34+细胞扩增4个天，根据绿色荧光蛋白进行转导和分类信号。随后，将转导的细胞接种在甲硫氨酸中。接种后2周对菌落进行评估。误差条代表s.d。三次测定。这个*P（P）*-使用t吨-测试**P（P）*<0.05, ***P（P）*<0.01. NS，不是重要。

图8。**PADI4活性与基因调控元件Tal1的模型，例如** **IL6ST（IL6ST）** 和 **CTCF公司。**
(一)PADI4作为激活器。Tal1新兵PADI4，它抑制PRMT6发布的H3R2me2a。作为一个结果H3K4me3保持在高水平，基因被转录。PADI4丢失时绑定H3R2me2a由PRMT6触发。随后，H3K4me3水平下降表达下调。(b条)PADI4作为阻遏物。Tal1招募PADI4，通过以下途径抑制H3R17me2aPRMT4和贡献导致基因低表达。PADI4结合丢失时，H3R17me2a为由PRMT4触发。随后，H3K4me3水平升高，表达上调。

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1. Robb L.等人。scl基因靶向破坏的小鼠缺乏卵黄囊造血。程序。美国国家科学院。科学。美国92、7075–7079（1995）。-项目管理委员会-公共医学
1. Porcher C.、Liao E.C.、Fujiwara Y.、Zon L.I.和Orkin S.H.《无直接DNA结合的bHLH转录因子SCL造血和血管发育规范》。发展1264603-4615（1999）。-公共医学
1. Visvader J.E.、Fujiwara Y.和Orkin S.H.T细胞白血病蛋白SCL/tal-1在血管发育中的作用不言而喻。《基因发展》12，473–479（1998）。-项目管理委员会-公共医学
1. Courtial N.等人。Tal1通过抑制细胞融合主调节因子DC-STAMP调节破骨细胞分化。FASEB J.26，523–532（2011年）。-公共医学

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[1] Shivdasani R.A.、Mayer E.L.和Orkin S.H.缺乏T细胞白血病癌蛋白tal-1/SCL的小鼠缺乏血液形成。《自然》373、432–434（1995年）。-公共医学

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[6] Porcher C.、Liao E.C.、Fujiwara Y.、Zon L.I.和Orkin S.H.《无直接DNA结合的bHLH转录因子SCL造血和血管发育规范》。发展1264603-4615（1999）。-公共医学

[7] Visvader J.E.、Fujiwara Y.和Orkin S.H.T细胞白血病蛋白SCL/tal-1在血管发育中的作用不言而喻。《基因发展》12，473–479（1998）。-项目管理委员会-公共医学

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[9] Courtial N.等人。Tal1通过抑制细胞融合主调节因子DC-STAMP调节破骨细胞分化。FASEB J.26，523–532（2011年）。-公共医学

[10] Courtial N.等人。Tal1通过抑制细胞融合主调节因子DC-STAMP调节破骨细胞分化。FASEB J.26，523–532（2011年）。-公共医学

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