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。2014年4月16日；9（4）：e94035。
doi:10.1371/journal.pone.0094035。 2014年电子收集。

葡萄糖激酶及其调节蛋白在下丘脑单核细胞中的动态定位

马格迪尔·萨尔加多 1, 埃斯特凡妮娅·塔里菲尼奥·萨尔迪维亚 1, 帕特里西奥·奥德涅斯 1, 卡罗拉·米兰 2, 玛丽亚·何塞·亚涅斯 1, 保拉·拉诺斯 1, 马科斯·维拉格拉 1, 罗伯特·埃利佐多·维加 1, 费尔南多·马丁内斯 1, 弗朗西斯科·努阿尔特 1, 埃琳娜·乌里韦 三, 玛丽亚·德·洛杉矶加西亚·罗伯斯 1
附属公司

葡萄糖激酶及其调节蛋白在下丘脑单核细胞中的动态定位

马格迪尔·萨尔加多等。 公共科学图书馆一号。 。

摘要

葡萄糖激酶（GK）是一种参与胰腺β细胞葡萄糖传感的己糖激酶，也在下丘脑单核细胞中表达，其覆盖基底下丘脑的心室壁，与葡萄糖间接控制神经元活动有关。此前，我们证明，在正常血糖大鼠中，GK优先定位于单核细胞核，这在肝细胞中已有报道，提示存在GK调节蛋白GKRP。在本研究中，使用共焦显微镜和Western blot分析比较了相同大鼠在几种血糖条件下下丘脑和肝脏组织中GK的细胞内定位。在高血糖状态下，下丘脑GK核定位增加；然而，在相同条件下，它主要定位于肝组织的细胞质中。GK和GKRP都是从原代培养的单核细胞中克隆出来的。在大肠杆菌中表达GK显示出一种功能性合作蛋白，其S0.5为10 mM。在酿酒酵母中表达的GKRP在体外抑制GK活性，Ki为0.2µM。我们还证明了GK和GKRP对单核细胞培养物中高糖浓度的反应性增加。这些数据通过核提取物的Western blot分析得到了证实。结果表明，GK受到核分区的短期调控。因此，在单核细胞中，GK可以作为一个分子开关来阻止细胞对葡萄糖升高的反应。

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数字

图1
图1。下丘脑GK的免疫定位和Western blot分析。
A-I公司，从暴露于不同血糖条件的动物身上获得大鼠下丘脑的额叶切片，并用兔抗GK（1∶100）进行免疫染色。空腹（A-C）、血糖正常（D-F）和高血糖（G-I）。C类，F类和我，GK免疫荧光伪彩色半定量分析（蓝色，阴性信号；黄色，中等信号；红色，高信号）。B、E和H中的插入物对应于使用用诱导肽预吸收的抗GK的免疫反应。J型定量分析不同血糖状态下单核细胞GK的核强度。采用单向ANOVA-Dunlet检验进行统计分析；P（P）-值<0.05被认为是显著的。数据表示每种情况下从五只动物获得的总计200个单核细胞中GK阳性核的平均荧光强度。K（K）、不同血糖条件下获得的核蛋白提取物中GK（52 kDa，上面板）和lamin-B1（68 kDa（下面板）的免疫印迹。L（左），GK核表达相对于lamin-B1的定量分析。GK的核定位随着血糖的升高而逐渐增加。采用单向ANOVA-Dunlet检验进行统计分析；P（P）-值<0.05被认为是显著的。J-L，1-3分别代表空腹、血糖正常和高血糖状态。数据表示六次独立测定的平均值±SD。III-V：第三脑室；Tβ1:β1单核细胞。比例尺，25µm。
图2
图2。肝脏GK的免疫定位和Western blot分析。
A-I公司，从暴露于不同血糖条件的动物身上获取肝脏切片，并用兔抗GK（1∶100）进行免疫染色。低血糖（A-C）、正常血糖（D-F）和高血糖（G-I）。C类，F类和我，GK免疫荧光伪彩色半定量分析（蓝色，阴性信号；黄色，中等信号；红色，高信号）。J型，定量分析不同血糖条件下肝细胞GK的核强度。采用单向ANOVA-Dunlet检验进行统计分析；P（P）-值<0.05被认为是显著的。数据表示总计200个肝细胞中GK阳性细胞核的平均荧光强度。K（K）、不同血糖条件下获得的核蛋白提取物中GK（52 kDa，上面板）和lamin-B1（68 kDa（下面板）的免疫印迹。L（左），GK核表达相对于lamin-B1的定量分析。GK的核定位随着血糖的升高而逐渐降低。采用单向ANOVA-Dunlet检验进行统计分析；P（P）-值<0.05被认为是显著的。J-L，1-3分别代表空腹、血糖正常和高血糖状态。数据表示六次独立测定的平均值±标准差。比例尺，100µm。
图3
图3。鉴定单核细胞中表达的GK和GKRP亚型。
一个，使用对胰腺GK（856 bp；上图）、肝脏GK（388 bp；上图）和β-肌动蛋白（353 bp；下图）具有特异性的引物，通过RT-PCR扩增GK序列。PCR产物从肝脏（1区）、胰腺（2区）、下丘脑（3区）、培养的单核细胞（4区）cDNA中扩增。阴性对照组包括下丘脑RT（-）（第5通道）和单核细胞（第6通道）。B类胰腺总蛋白提取物（第1道）、下丘脑（第2道）和单核细胞培养物（第3道）中GK的免疫印迹，使用预吸收抗体的阴性对照（第4道）。C类，RT-PCR，使用肝脏（1区）、下丘脑（2区）、单核细胞（3区）和胰腺（4区）cDNA扩增GKRP（418 pb；上区）和β-肌动蛋白（353 bp；下区）。阴性对照组包括下丘脑RT（-）（第5通道）和单核细胞（第6通道）cDNA。D类，肝总蛋白提取物（1区）、下丘脑（2区）和单核细胞培养物（3区）中GKRP的免疫印迹，省略抗GKRP（4区）。
图4
图4。下丘脑单核细胞表达GK和GKRP。
A–F使用抗波形蛋白（绿色）和Topro-3核染色（蓝色）对免疫荧光进行共焦显微镜分析。A–C大鼠额叶下丘脑40μm切片显示波形蛋白在α和β单核细胞中表达。D–F型、单核细胞原代培养物，保持其极化和波形蛋白表达。G–J型，5培养的单核细胞中GK的免疫检测。5 mM葡萄糖。K–N（K–N），在5.5 mM葡萄糖中培养的单核细胞中免疫检测GKRP。
图5
图5。GK的动力学特征及其被GKRP抑制。
一个，使用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联方法，我们评估了重组GK与1 mM ATP和pH 7.5的葡萄糖磷酸化的浓度依赖性。B类，对A中显示的数据进行希尔图分析，显示出与S的正合作关系0.510 mM和1.5 nH（H）。C类，GKRP（0.05–0.25µM）对GK活性的抑制作用。正如肝细胞中的报道，GKRP以剂量依赖性的方式抑制胶质细胞GK，导致中等抑制浓度（IC50)0.28 mM。D类，GKRP对葡萄糖引起的GK饱和度的影响，显示0.1和0.2µM GKRP的最大反应速度降低。E类，由于GK的合作行为，我们对D的数据进行了Segel-proposed绘图，以确定抑制常数（K我)GKRP对GK。结果代表了三个独立实验的平均值±标准差。
图6
图6。葡萄糖对培养单核细胞GK的动态定位反应。
A–DGK免疫定位（红色）在用0.5 mM葡萄糖预孵育6 h（A–B）或用15 mM葡萄糖孵育30 min（C–D）的单核细胞中。细胞核（A–C）和波形蛋白（B，D）分别染色为蓝色和绿色。箭头和箭头分别显示细胞核和细胞质GK定位。图像通过Z轴叠加重建获得，白线表示横向和下部面板中显示的正交平面（XZ和YZ）。E类，在存在0.5 mM（通道1）和15 mM（路径2）葡萄糖的情况下培养的单核细胞中GK免疫荧光的核强度。结果表示来自三个独立原代培养物的200个细胞的平均±sd。F类用0.5 mM（第1道）和15 mM（第一道）葡萄糖培养的细胞获得的核提取物中的GK（52 kDa，上表）和核标记物lamin-B1（68 kDa（下表）的免疫印迹。G公司用western-blot评估GK核表达水平，并用lamin-B对用0.5 mM（1区）和15 mM（2区）葡萄糖培养的细胞进行量化和标准化。数据显示了六个独立实验的平均值±SD。*p<0.05；**p<0.01。A–D中的比例尺，50µm。
图7
图7。葡萄糖对培养的单核细胞GKRP的动态定位。
一个–D类GKRP在用0.5 mM葡萄糖预孵育6 h（A–B）或用15 mM葡萄糖孵育30 min（C–D）的单核细胞中的免疫定位（红色）。细胞核（A–C）和波形蛋白（B，D）分别染色为蓝色和绿色。箭头和箭头分别显示细胞核和细胞质GKRP定位。图像通过Z轴叠加重建获得，白线表示横向和下部面板中显示的正交平面（XZ和YZ）。E类，在存在0.5 mM（通道1）和15 mM（路径2）葡萄糖的情况下培养的单核细胞中GKRP免疫荧光的核强度。结果表示来自三个独立原代培养物的200个细胞的平均±sd。F类、GKRP（69 kDa，上表）和核标记lamin-B1（68 kDa（下表））的免疫印迹，这些核标记物是从培养有0.5 mM（1区）和15 mM（2区）葡萄糖的细胞中获得的。G公司用western-blot评估GKRP核表达水平，并用lamin-B对用0.5 mM（1区）和15 mM（2区）葡萄糖培养的细胞进行量化和标准化。数据显示了六个独立实验的平均值±SD。*p<0.05；**p<0.01。A-D中的比例尺，50µm。
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    1. Schwartz MW、Woods SC、Porte D Jr、Seeley RJ、Baskin DG（2000）《食物摄入的中枢神经系统控制》。自然404:661-671。-公共医学
    1. Song Z，Routh VH（2005）葡萄糖和乳酸对下丘脑腹内侧核内葡萄糖敏感神经元的差异作用。糖尿病54:15-22。-公共医学
    1. Yang XJ，Kow LM，Funabashi T，Mobbs CV（1999）下丘脑葡萄糖传感器：与胰腺β细胞机制的相似性和差异性。糖尿病48:1763-1772。-公共医学
    1. Chauvet N、Parmentier ML、Alonso G（1995）成年下丘脑-神经垂体神经元的横断轴突沿着单核细胞过程再生。神经科学研究杂志41:129-144。-公共医学
    1. Flament-Durand J，Brion JP（1985）《单核细胞：形态和功能：综述》。国际细胞评论96:121–155。-公共医学

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