跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https公司

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2014年10月；16(5):608-18.
doi:10.1007/s11307-014-0736-1。

使用抗体检测系统对猝灭活性光学成像探针进行显微检测：定位蛋白酶活性

伊桑·沃克 1, 拉马穆尔西·戈帕拉克里什南（Ramamurthy Gopalakrishnan）, 马修·博吉, 詹姆斯·巴西利翁
附属公司

使用抗体检测系统对猝灭活性光学成像探针进行显微检测：定位蛋白酶活性

伊桑·沃克等。 分子成像生物. 2014年10月.

摘要

目的：组织蛋白酶家族在正常生理学和许多人类疾病的生理学中都发挥着重要的生理作用。这种活性在许多癌症中上调，可用于体内和离体肿瘤成像。为了表征局部应用的猝灭荧光活性探针GB119的体外行为，我们开发了一种基本的免疫组织化学技术来识别组织中未抑制的GB119。

程序：免疫印迹分析用于验证anit-Cy5抗体用于检测组织蛋白酶L产生的未经抑制的GB119的效用。在验证抗Cy5抗体后，建立了一种免疫组织化学方法来检测来自原位小鼠模型的脑肿瘤冰冻切片中未抑制GB119的存在。

结果：这些研究表明，抗Cy5抗体优先识别未经抑制的GB119，并且这种差异可以用于识别大脑和肿瘤中包含未经抑制GB119的区域。使用H&E染色和针对其他生化标记物的抗体，进一步确定未经修饰的GB119定位于肿瘤周围间隙，并与组织蛋白酶L的表达共存。

结论：我们的数据表明，这种方法可以对未经抑制的GB119进行高分辨率检测，这些GB119可以与其他免疫组织学染色相关联。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突。JPB和MB都是Akrotome Imaging Inc.的董事会成员和联合创始人。Akrotome是一家开发光学造影剂的公司，并已授权凯斯西储和斯坦福大学使用本手稿中描述的技术。这不会改变作者对MIB共享数据和材料的所有政策的遵守。

数字

图1
图1。未抑制GB119的免疫识别机制
GB119由四部分组成：i）一种对半胱氨酸蛋白酶具有特异性的反应元件（弹头），ii）通常包含识别元素的链接器，iii）用于检测的荧光分子（Cy5），以及iv）使Cy5保持光学静音的猝灭剂部分（QSY 21）。当qABP处于淬灭状态时，预计QSY 21可能会限制抗Cy5抗体的Cy5的可用性。GB119的激活和抑制释放QSY 21，并允许抗Cy5抗体与Cy5结合。每个抗Cy5抗体在结合后携带3到6个荧光素分子，用于放大Cy5标记探针的存在，每个未经抑制的GB119分子只有一个Cy5。
图2
图2。组织蛋白酶L诱导的GB119抑制增加了GB119中Cy5对抗Cy5抗体的可用性在体外
a） 分析验证用Cy5标记的驴IgG（Dky-IgG/Cy5）粘附在硝化纤维素膜（NCM）上，然后用未经处理的抗Cy5抗体（Anti-Cy5 Ab）或用驴Dky IgG/Cy5预吸附的抗Cy抗体（Anti-Cy5 Ab，Dky-IgG/Cy5）进行检测。当抗Cy5未被预吸附时，数据被归一化为测量的平均信号。彩色插页表示使用Maestro成像设备从硝化纤维测量的典型信号。b） 用GB119预吸附抗Cy5-Ab.Dky IgG/Cy5粘附在NCM上，然后用i）抗Cy5抗体与猝灭的GB119（anti-Cy5，GB119）预孵育；ii）用GB119预孵育的抗Cy5抗体，该抗体首次未受人组织蛋白酶L（CTS-L）的影响（抗Cy5Ab，GB119，CTS-L）；和iii）预先与GB119孵育的抗Cy5抗体，在含有通用木瓜蛋白酶家族蛋白抑制剂JMP-OEt（PI）（即阴性对照）的情况下，未与人CTS-L发生作用（抗Cy5-Ab，GB119，CTS-L，PI）。彩色插页表示使用Maestro成像设备从硝化纤维测量的典型信号。c）用Cy5标记驴抗体的NCM印迹的抗Cy5抗体荧光伪绿色图像（b）通过Leica显微镜（1.25x）拍摄，表明差异适合于组织中未冷却的GB119的可视化。d）GB119在NCM上的预洗印迹与i）仅CTS-L，ii）PBS单独或作为对照iii）CTS-L和超出PI，或iv）PBS和PI的混合物。荧光图像表明，只有在不含抑制剂的情况下，CTS-L才能对GB119产生强烈的抑制作用。PBS本身并没有影响GB119。e）Cy5荧光水平的定量分析。f）嵌装硝化纤维膜（2天）用荧光标记的抗Cy5抗体进行探测，并进行荧光成像。结果与插图中确定的结果相似（d）.g）抗Cy5抗体荧光水平的定量分析。对于a）信号差异显著，p<0.001；对于b）将信号与抗Cy5Ab、GB119进行比较，两种情况下的差异均显著，分别为p＜0.001和p＜0.05。统计数据（e）和（g）表示为荧光的平均水平，从中减去仅匹配PBS的对照。对于d） 第页<0.001; 对于g） 第页<0.05. Cy5荧光（发射滤波器=645 nm）；抗Cy5抗体的荧光（发射过滤器=515 nm）。误差条表示+SD。
图3
图3。使用抗Cy5抗体检测GB119的肿瘤裂解物
将等量的GB119放在硝化纤维过滤器上，然后与兔多克隆IgG（对照）或从人Gli36Δ5癌细胞系中提取的细胞裂解物培养至不影响GB119。硝酸纤维素膜成像用于：a）Cy5荧光或b）抗Cy5抗体信号（荧光素）。直接Cy5荧光信号与GB119检测到的抗Cy5抑制信号之间的相关性在inset中具有统计相关性（c）.竖条（a）和（b）表示每个裂解物浓度点的平均荧光+SD。采用Spearman秩相关检验（r=0.9；p<0.01）分析两种荧光水平之间的关系（c）.
图4
图4。GB119在含有肿瘤的脑切片上的局部应用不影响GB119
小鼠单侧立体定向注射Gli36Δ5肿瘤细胞。9-10天后，将动物处死，并按插图所示对其大脑进行切片（a）&（b）在应用GB119之前，没有自动荧光，插图（c）,左边应用GB119 30分钟后，通过肿瘤周围可见的荧光消除GB119的显著影响，插图（c）,正确的。显示单个鼠标的代表性图像（n=3）。（a）&（b） ：黑色星号–可见的Gli356Δ5肿瘤异种移植；（c） ：白色轮廓–用于探头应用的脑组织表面周长。白色星号和粉红色虚线轮廓–肿瘤异种移植物的位置和大致可见周长。
图5
图5。组织切片的免疫组织化学分析可以检测到GB119的未淬灭
图4中的大脑切片垂直于切片平面切割，如插图所示（a）并进行IHC分析。b）插图中描述的切割切片的H&E染色（a）肿瘤清晰可见黑色星号。 c）相邻组织切片未经抑制的GB119的抗Cy5抗体染色。灰色箭头突出显示抗Cy5染色，绿色。这个虚线白线插入（a）接近组织切片的边缘，这些边缘被探头探头重叠。白色星号–近似肿瘤异种移植的可见部分（见图4）；比例尺–500μm。d）组织学图像（b）和Cy5的IHC染色图像（c）覆盖。红色箭头注明局部应用GB119的位置。
图6
图6。GB119的未淬灭定位于肿瘤周围间隙，与肿瘤细胞、巨噬细胞和组织蛋白酶L的表达有关
图4中的大脑切片垂直于切片平面切割，如插图所示（a）并进行免疫组化分析。b）插图中描述的切割切片的H&E染色（a）.Boxed区域对应于插图中各节的近似区域（c） 。c）第1-8帧：免疫和H&E染色对应于插图中装箱的区域1-8（b）图像由三种染色组成：抗Cy5抗体染色(假红色)组织蛋白酶-L（CTS-L）(假绿色)以及是否存在癌组织（波形蛋白-假蓝色). y轴ellow或ange颜色代表沿着肿瘤边缘和样品表面上的Cy5/CTS-L共配准的区域。紫色表示CTS-L和波形蛋白共同定位。第九框架（绿色框）：H&E和IHC染色覆盖层源自肿瘤区域的相邻部分，插图中显示为绿色方框（b）重叠染色显示巨噬细胞和未抑制的GB119共存，但一些巨噬细胞未与未抑制的GB 119共存。在非肿瘤区域未发现巨噬细胞（数据未显示）。未淬火GB119(假红色)、肿瘤组织（波形蛋白染色-假蓝色)和巨噬细胞（CD11b染色-假绿色). y轴ellow或ange颜色代表Cy5/CD11b（巨噬细胞）共同注册的区域。黑色虚线–近似肿瘤异种移植的边缘。红色箭头指示探头局部应用的表面和探头穿透的方向；比例尺=100μm。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

  • 热敏成像水凝胶的配方，用于局部应用和手术腔中肿瘤边缘的快速可视化。
    Walker E、Linders DGJ、Abenojar E、Wang X、Hazelbag HM、Straver ME、Bijlstra OD、March TL、Vahrmeijer AL、Exner A、Bogyo M、Basilion JP、Straight B。 Walker E等人。 癌症（巴塞尔）。2022年7月16日；14(14):3459. doi:10.3390/cancers14143459。 癌症（巴塞尔）。2022 PMID：35884520 免费PMC文章。
  • 肿瘤蛋白水解景观：癌症诊断和治疗的挑战性前沿。
    Vizovisek M、Ristanovic D、Menghini S、Christiansen MG、Schuerle S。 Vizovisek M等人。 国际分子科学杂志。2021年3月3日；22(5):2514. doi:10.3390/ijms22052514。 国际分子科学杂志。2021 PMID：33802262 免费PMC文章。 审查。
  • 蛋白酶激活荧光探针可在切除过程中快速显示角化细胞癌。
    Walker E、Liu Y、Kim I、Biro M、Iyer SR、Ezaldein H、Scott J、Merati M、Mistur R、Zhou B、Straight B、Yim JJ、Bogyo M、Mann M、Wilson DL、Basilion JP、Popkin DL。 Walker E等人。 癌症研究，2020年5月15日；80(10):2045-2055. doi:10.1158/0008-5472.CAN-19-3067。Epub 2020年3月4日。 癌症研究2020。 PMID：32132111 免费PMC文章。
  • 手术切除的非黑色素瘤皮肤癌标本边缘的分子成像和验证。
    Liu Y、Walker E、Iyer SR、Biro M、Kim I、Zhou B、Straight B、Bogyo M、Basilion JP、Popkin DL、Wilson DL。 刘毅等。 医学成像杂志（Bellingham）。2019年1月；6(1):016001. doi:10.1117/1.JMI.6.1.016001。Epub 2019年3月18日。 医学成像杂志（Bellingham）。2019 PMID：30915384 免费PMC文章。
  • 非黑色素瘤皮肤癌的快速可视化。
    Walker E、Mann M、Honda K、Vidimos A、Schluchter MD、Straight B、Bogyo M、Popkin D、Basilion JP。 Walker E等人。 美国皮肤病学会杂志。2017年2月；76（2）：209-216.e9。doi:10.1016/j.jaad.2016.09.008。Epub 2016年11月19日。 美国皮肤病学会杂志。2017 PMID：27876303 免费PMC文章。
查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Reiser J，Adair B，Reinheckel TJ。半胱氨酸组织蛋白酶在健康和疾病中的特殊作用。临床投资杂志。2010;120:3421–3431.-项目管理委员会-公共医学
    1. Bromme D，Wilson S.半胱氨酸组织蛋白酶在细胞外蛋白水解中的作用。收件人：Parks WC，Mecham RP，编辑。细胞外基质生物学。第2卷。柏林：施普林格；2011年，第23–51页。
    1. Mohamed MM，Sloane BF。半胱氨酸组织蛋白酶：癌症中的多功能酶。Nat Rev癌症。2006;6:764–775.-公共医学
    1. 巴勒莫C，乔伊斯JA。半胱氨酸组织蛋白酶作为癌症的药理靶点。药物科学趋势。2008;29:22–28.-公共医学
    1. Blum G、Weimer RM、Edgington LE、Adams W、Bogyo M。底物和基于活性的探针作为半胱氨酸蛋白酶活性无创光学成像工具的比较评估。公共科学图书馆一号。2009;4:e6374。-项目管理委员会-公共医学

出版物类型

LinkOut-更多资源