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.2014年2月13日；9（2）：e88450。
doi:10.1371/journal.pone.0088450。 2014年电子收集。

胰岛素和氯化锂协同拯救FoxO1过度表达成肌细胞的肌源性分化

吴一菊 1, 颜新芳 1, 祥成池 1, 李昌昌 1, 施英忠 1, 黄伟建 1, 王晓文 1, 李宽伟 1, 沈良晨（Shen Liang Chen） 1
附属公司

胰岛素和氯化锂协同拯救FoxO1过度表达成肌细胞的肌源性分化

吴一菊等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

最近的研究报告称，FoxO1转录因子是退血条件下肌生成的负调控因子，这种情况在体内实际上没有发现。因此，FoxO1在肌肉发生中的作用应该在更生理相关的条件下重新检查。在这里，我们发现FoxO1优先定位于增殖（PMB）和融合成肌细胞（CMB）的细胞核，其核排斥是形成多核肌管（MT）的先决条件。钩端霉素B可以阻止FoxO1在PMB中的核穿梭，我们进一步发现，FoxOl在肌管中的细胞质积累是由于其核输入被阻断所致。尽管野生型FoxO1在C2C12成肌细胞中的过度表达显著阻止了其在停血清条件下的肌源性分化，但胰岛素和Wnt信号通路激活剂LiCl对这些细胞的应用成功地挽救了其肌源性的分化，并生成了直径更大的肌管。有趣的是，胰岛素治疗显著降低了FoxO1水平，并延迟了由丝裂原剥夺触发的FoxOl核再积累。我们进一步发现FoxO1直接抑制了肌生成基因的启动子活性，胰岛素和氯化锂治疗可以缓解这种抑制。这些结果表明，FoxO1在血清戒断状态下抑制肌生成，但在其他肌生成信号（如Wnt和胰岛素）可用时会变成肥大增强因子。

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利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。成立福克斯O1过表达C2C12稳定克隆。
对照组和C2C12中FoxO1蛋白的表达水平-福克斯O1通过蛋白质印迹检测稳定的克隆。抗体识别FoxO1的天然（底部带）和磷酸化（顶部2带）形式。Gapdh的信号作为蛋白质输入控制。以千道尔顿（Kd）为单位的蛋白质标记如（A）所示。wt：野生型；AAA：组成活性突变体。(B)和(C类)汇合的福克斯O1通过改变分化培养基（DM）诱导过度表达的C2C12稳定克隆分化，96小时后收获用于肌球蛋白重链（MHC，红色）的免疫组织化学染色。用苏木精进行反染色后，拍摄这些稳定克隆的形态并显示在（B）中。最初的放大倍数是100倍。（C） ，在至少3-5个代表区域中计算稳定克隆的融合指数（MHC阳性肌管中的细胞核百分比），并至少重复两次分化试验。**：与对照细胞相比p＜0.01。
图2
图2。在肌源性分化过程中，FoxO1在细胞核和细胞质之间穿梭。
FoxO1在C2C12-FoxO1-wt中的亚细胞定位(A类),控制(C类),和C2C12-FoxO1-AAA(D类)免疫荧光显微镜检测增殖期（PMB）、融合期（CMB）和肌管期（MT）细胞。这些阶段FoxO1在C2C12-FoxO1-wt细胞中的相对分布如所示(B). 分别用Alexa fluor 488（绿色）和486（红色）检测FoxO1和MHC信号，结合二级抗体，细胞核用DAPI（蓝色）染色。底部面板上的箭头指向肌管。乌德：无法检测。原始放大倍数为200倍。(E类)将表达GFP-FoxO1-wt（顶面板）或GFP-Fox O1-AAA（底面板）的载体转染到肌管期的亲代C2C12细胞（糖尿病患者4天），转染24小时后观察多核肌管中的GFP信号（用MHC抗体检测，红色）。(F类),和(G公司),FoxO1的核穿梭被暂停在肌管中。增殖成肌细胞(F类)和分化的肌管(G公司)C2C12-FoxO1-wt用溶媒或钩体霉素B（LPB，2 ng/ml）处理24 h，然后固定，并如上所述对FoxO1和MHC进行染色。（E）、（F）和（G）的原始图像是在放大400倍的条件下拍摄的。
图3
图3。氯化锂和胰岛素协同拯救FoxO1过表达稳定克隆的终末分化。
控制和FoxO1在缺乏或存在胰岛素（50 nM）和/或氯化锂（5 mM或10 mM）的情况下诱导过表达细胞分化96小时。然后固定细胞并用免疫细胞化学观察MHC信号（红色）。对照组和FoxO1（wt或–AAA）过表达细胞在不同处理下的形态如图所示(A类),(B),和(C类),它们的融合指数和不同处理下每个肌管的细胞核数分别显示为(D类)和(E类),分别。*和**：与仅用载体处理的细胞相比，分别为p<0.05和p<0.01；#和#：与相同处理下的对照细胞相比，分别为p<0.05和p<0.01。(F类).关键肌源性因子的核水平控制和C2C12-FoxO1-重量用Western blot检测胰岛素（50 nM）和/或氯化锂（10 mM）处理4天的细胞。拉明B1的信号用作蛋白质输入（15µg核蛋白）控制。
图4
图4。胰岛素和氯化锂处理对FoxO1亚细胞定位的影响。
用免疫荧光显微镜检测FoxO1在C2C12-FoxO1-wt细胞中的亚细胞定位，用胰岛素和氯化锂处理2天和4天，结果如图2所示(A类)和(B)分别是。在各种处理下，具有细胞核或细胞质FoxO1定位的成肌细胞和多核肌管的相对百分比如（C）和（D）所示。箭头和箭头分别表示MHC阳性成肌细胞（单核）和多核肌管。原始图像是在放大200倍的条件下拍摄的。ud：无法检测。
图5
图5。胰岛素延缓FoxO1的核积聚。
(A类)分别用免疫荧光显微镜和蛋白质印迹检测用DM代替GM后不同时间点C2C12-FoxO1-wt细胞中FoxO1的亚细胞定位和表达水平，如图所示。2。右下角显示了不同时间点具有核或细胞质FoxO1定位的成肌细胞的相对百分比。这些时间点的总裂解物（50µg）中FoxO1和β-Catenin的表达水平显示在左下面板中，Gapdh的信号用作输入控制。对含有两种胰岛素的DM进行了类似实验(B)或氯化锂(C类).
图6
图6。FoxO1抑制肌原基因的启动子活性。
(A类)肌源性基因的表达水平控制和C2C12-FoxO1-重量通过实时定量RT-PCR确定MT期的稳定克隆。将每个基因的表达水平标准化为Gapdh公司（ΔCt）。将C2C12-FoxO1-wt细胞中每个基因的正常表达水平与对照细胞进行比较，并将比率（2-ΔΔCt)如图所示。所示结果为两个独立实验的平均值±标准差。*和**：与对照细胞相比，分别为p<0.05和p<0.01。(B)肌原基因启动子驱动的报告子与pCDNA3共转染-福克斯O1矢量输入C2C12以测试福克斯O1其启动子活性的表达。在没有FoxO1的情况下，每个报告者的荧光素酶活性被任意设置为1倍激活，并将其在FoxO2的情况下的活性与之进行比较。(C类)转染C2C12细胞甲基安非他明类兴奋剂启动子驱动的报告子和表达载体福克斯O1-wt和–AAA级用胰岛素（50 nM）和/或氯化锂（10 mM）治疗。荧光素酶活性甲基安非他明类兴奋剂在没有福克斯O1表达载体被任意设置为1倍激活。显示的结果是至少3个独立实验的平均值和S.D.。*和**：与仅转染报告基因和空表达载体的细胞相比，分别p<0.05和p<0.01。#：与载体处理下转染报告基因和相同表达载体的细胞相比，p<0.05。
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赠款和资金

本研究得到台湾国家科学委员会（NSC-93-2311-B-008-008、NSC-94-2311-B-007-002和NSC-95-2311-B-004-002）和台湾大学系统脑研究中心的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。