The accumulation of misfolded proteins in the mitochondrial matrix is sensed by PINK1 to induce PARK2/Parkin-mediated mitophagy of polarized mitochondria

doi:10.4161/auto.26122

.2013年11月1日；9(11):1750-7.

doi:10.4161/auto.26122。 Epub 2013年9月5日。

PINK1检测线粒体基质中错误折叠蛋白的积累，以诱导极化线粒体的PARK2/Parkin介导的有丝分裂

Seok Min Jin先生¹, 理查德·尤尔

附属公司

PMID： 24149988
PMCID公司：项目经理4028334
内政部： 10.4161/自动26122

PINK1检测线粒体基质中错误折叠蛋白的积累，以诱导极化线粒体的PARK2/Parkin介导的有丝分裂

Seok Min Jin先生等。自噬. 2013.

.2013年11月1日；9(11):1750-7.

doi:10.4161/auto.26122。 Epub 2013年9月5日。

作者

Seok Min Jin先生¹, 理查德·尤尔

附属

¹生物化学科；外科神经科；国家神经疾病和中风研究所；美国国立卫生研究院；美国马里兰州贝塞斯达。

PMID： 24149988
PMCID公司：项目经理4028334
内政部： 10.4161/自动26122

摘要

线粒体缺陷对宿主细胞产生有害影响。为了控制这种风险，线粒体显示了几种质量控制机制：线粒体特异性伴侣和蛋白酶在分子水平上防止错误折叠的蛋白质，分裂/融合和有丝分裂在细胞器水平上隔离和消除损伤。线粒体中未折叠蛋白的增加激活线粒体未折叠蛋白反应（UPR（mt））以增加伴侣的产生，而线粒体激酶PINK1和E3泛素连接酶PARK2/Parkin的突变导致家族性帕金森病，通过线粒体吞噬去除去极化线粒体。然而，尚不清楚这些不同级别的质量控制（QC）之间是否存在联系。在这里，我们表明，基质中未折叠蛋白的表达导致PINK1在能量充足的健康线粒体上积聚，导致PARK2的线粒体移位、线粒体吞噬以及随后未折叠蛋白负荷的减少。此外，LONP1蛋白酶的敲除大大增强了PINK1的积累。我们认为线粒体中未折叠蛋白的积累是有丝分裂的生理触发因素。

关键词：LONP；停车场2/停车场；粉红色1；线粒体；有丝分裂；未展开的蛋白质反应。

PubMed免责声明

数字

**图1。**线粒体基质中ΔOTC的表达诱导全长PINK1的积累，而不损失膜电位。(A类)用载体或ΔOTC构建体瞬时转染HeLa细胞48小时，然后分级。线粒体和核组分直接溶解在1×样品缓冲液中，并与所示抗体进行免疫印迹。ATP5A1（ATP合成酶，H⁺转运、线粒体F1复合物、α亚基1、心肌）、TOMM20和LMNB1作为每个组分的负荷控制。(B类)用多西环素（Dox；1μg/ml）处理由表达wtOTC或ΔOTC的逆转录病毒稳定转导的HeLa-TetOn细胞72 h。将一半样品溶解在1x样品缓冲液中，另一半分为0.5%Triton X-100可溶和不可溶部分。分析每个组分的PINK1和/或OTC表达。TUBA起到了装载控制的作用。(C类)ΔOTC/HeLa TetOn细胞在有或没有Dox（1μg/ml）的情况下孵育72小时。72小时后，分离细胞，用TMRE染色，并用FACS分析TMRE的强度。作为阴性对照，未经处理的细胞在FACS分析前用TMRE染色并用CCCP（2μM）处理。FACS结果表示为三个独立实验的平均值±SEM。(D类)ΔOTC/HeLa-TetOn细胞用CCCP（10μM）处理2 h或Dox（1μg/ml）处理72 h，然后用所示抗体进行免疫印迹分析。A CTB、TOMM20、HTRA2和HSPA9分别作为总蛋白、OMM、IMS和基质蛋白的负荷控制。(E类)用PINK1-YFP/IRES（内部核糖体进入位点）/DsRed构建物瞬时转染ΔOTC/HeLa-TetOn细胞24小时，然后按照(D类). 共聚焦显微镜分析表达DsRed细胞中PINK1-YFP的积累和线粒体形态。比例尺：20μm。左侧面板中的白色方框在右侧被放大。

**图2。**ΔOTC表达积累的PINK1暴露于细胞液中，激活PARK2并诱导有丝分裂。(A类)用Dox（1μg/ml）处理ΔOTC/HeLa-TetOn细胞72小时。分离线粒体，并按照材料和方法中所述的指示浓度用蛋白酶K进行蛋白酶保护试验。用所示抗体通过免疫印迹法测定保护蛋白水平。(B类)用载体wtOTC或ΔOTC瞬时转染稳定表达YFP-PARK2的HeLa细胞。转染48小时后，用TMRE对细胞进行染色，并用共焦显微镜进行成像。将转染载体的一个复制品在TMRE染色前用CCCP（10μM）处理2小时作为对照。比例尺：20μm。(C类)用载体或ΔOTC瞬时转染稳定表达YFP-PARK2和mito-DsRed的HeLa细胞72 h，然后通过共聚焦显微镜分析其有丝分裂*细胞未显示有丝分裂-DsRed信号。比例尺：20μm。(**D和E**)用Dox（1μg/ml）处理具有或不具有稳定表达YFP-PARK2的ΔOTC/HeLa-TetOn细胞72 h(D类)或120小时(E类)存在或不存在自噬抑制剂，巴非霉素A₁（BAF），最后24小时(D类). 用所示抗体通过western印迹分析全细胞裂解物。HSPA9和GAPDH分别作为线粒体和总蛋白的负荷控制。

**图3。**内源性LONP1可减轻ΔOTC和PINK1的积累。(**A–D**)ΔOTC/HeLa-TetOn(**A和D**)或ΔOTC/YFP-PARK2/HeLa-TetOn(**B和C**)用非靶向对照（CTRL）转染稳定细胞系，*化学发光二极管*或*伦敦P1*siRNA。24小时后，用Dox（1μg/ml）处理细胞72小时(A类)用所示抗体进行western blotting分析PINK1和ΔOTC水平以及敲除效率。TUBA、TOMM20、HTRA2和HSPA9分别作为总蛋白、OMM、IMS和基质蛋白的负荷控制。(**B和C**)线粒体上带有YFP-PARK2的细胞数量(B类)或线粒体的数量(C类)在每个实验环境中进行计数****P（P）*< 0.001; 不另作说明，不重要。计数结果表示为三个独立实验的平均值±SEM。(D类)使用FACS分析，如图1E所示测量各组的TMRE强度。FACS结果表示为三个独立实验的平均值±SEM。

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