Intracellular gene transcription factor protein-guided MRI by DNA aptamers in vivo

doi:10.1096/fj.13-234229

.2014年1月；28(1):464-73.

doi:10.1096/fj.13-234229。 Epub 2013年10月10日。

DNA适配体介导的细胞内基因转录因子蛋白导向MRI研究

克里斯蒂娜·H·刘¹, 贾谦仁, 刘昌明, 菲利普·K·刘

附属公司

PMID： 24115049
PMCID公司：项目经理3868842
内政部： 10.1096/fj.13-234229

DNA适配体介导的细胞内基因转录因子蛋白导向MRI研究

克里斯蒂娜·H·刘等。美国财务会计准则委员会J. 2014年1月.

.2014年1月；28(1):464-73.

doi:10.1096/fj.13-234229。 Epub 2013年10月10日。

作者

克里斯蒂娜·H·刘¹, 贾谦仁, 刘昌明, 菲利普·K·刘

附属

¹3马萨诸塞州总医院，149（2301）CNY149，Thirtenth St.，Charlestown，MA 02129，USA。philipl@nmr.mgh.harvard.edu。

PMID： 24115049
PMCID公司：项目经理3868842
内政部： 10.1096/fj.13-234229

摘要

转录因子（TF）蛋白AP-1调节安非他明对活体大脑中基因转录的影响的机制尚不清楚。我们在这里描述了我们研究这些机制的第一部分，特别是我们开发和验证包含TF AP-1（5ECdsAP1）结合序列的适配体，以阐明其在活体大脑中的作用机制。该AP-1靶向适配体以及无靶点的随机序列适配体（5ECdsRan）作为对照，经部分硫代磷酸修饰，并用超顺磁性氧化铁纳米粒子（SPIONs）、金或异硫代硫氰酸荧光素造影剂进行标记，以便成像。光学和透射电镜研究表明，5ECdsAP1被内吞作用占据，并定位于神经元内质网。SPION-5ECdsAP1磁共振成像（MRI）结果显示，苯丙胺暴露后活雄性C57black6小鼠神经元AP-1 TF蛋白水平升高；然而，用多巴胺受体拮抗剂SCH23390预处理抑制了这种升高。对含有神经元显性阴性A-FOS突变蛋白的转基因小鼠的研究表明，纹状体中的MRI信号完全无效，该突变蛋白与AP-1序列没有结合亲和力，因此我们可以得出结论，MR信号反映了5ECdsAP1适配体与内源性AP-1蛋白之间的特异性结合。总之，这些数据支持了5ECdsAP1适配体在细胞内蛋白引导成像和基因转录调控中的应用，从而可以研究活体大脑中的信号转导机制。

关键词：AP1淘汰赛；注意力；单胺氧化酶A；强调；转基因小鼠。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
Aptamer亲和力。A类)我们测试了*在体外*在5或0.5mM DTT存在下，dsAP1适体与各种EC与rh-AP1蛋白的结合。B类)通过传统的凝胶位移分析，所有适体对rh-NF-κβ蛋白的特异性。C类)我们研究的协议时间。

**图2。**
适配体的摄取和分配。为了检测AP-1适配体的细胞特异性摄取，我们输送了FITC-5ECdsAP1（120 pmol/kg，静脉注射）。然后我们给予生理盐水（SAL；*A–D*)或安非他明（AMPH；4 mg/kg，静脉注射；*E–I公司*)3小时后(n个=2个）；在生理盐水或安非他明（15）后4h获得冷冻脑标本。A类,E类)对脑组织进行染色以进行FITC-5CdsAP1检测。B类,F类)对脑组织进行染色以检测细胞核。C类,*G公司*)用新鲜的4%多聚甲醛处理脑组织，以标记星形胶质细胞表达的GFAP[Cy3-标记的抗GFAP抗体（ab7260；Abcam）和核酸的Hoechst（紫色）染色]。D类,小时)合并的图像。我)FITC-5ECdsAP1位于用碘化丙啶染色的神经元细胞核（直径约10μm）附近。比例尺=10μm。

**图3。**
适配体的亚细胞分布：以40μg Fe/kg的剂量传递SPION-5ECdsAP1或AU-5ECdsAPI(*A–C*)或40μg Au/kg(*D–E型*)，静脉注射）。我们注射了安非他明(n个=2个），如材料和方法所述；在分娩后4小时，我们从NAc中获取脑样本，并在准备TEM时固定组织进行全染色(A类)以及不含锇和醋酸铀酰的染色(*B–D类*)和铅(E类)，如材料和方法中所述。面板中的箭头B类和D类显示在ER中蛋白质翻译位点发现了几个EDN。面板中的箭头D类和E类表明EDN不是与铅染色相关的伪影。G、胶质细胞；N、基于直径的神经元细胞核。

**图4。**
SPION-5ECdsAP1靶向MRI（40μg Fe/kg或120 pmol dsAP1/kg，静脉注射）。A类)MRI采集协议和数据处理方法。B类)减法运算中MR信号强度增加*R（右）*₂*地图。*C–E类*)MRI信号下降的频率(*R（右）*₂*或1/T型₂*ms×1000）表示为Δ的增加百分比*R（右）*₂*3组小鼠的地图：盐水（SAL）与。安非他明（AMPH）(C类)或SCH23390与。AMPH公司(D类,E类). 条形图显示平均值±扫描电镜(t吨测试，与SAL控制）用于SPION-5ECdsAP1后活体大脑中各种ROI中的SPION保留。F类)我们获得MRI数据的解剖ROI。

**图5。**
SPION-5ECdsAP1在活体大脑中的分布。安非他明1次典型治疗后AP-1 TF蛋白引导的全脑MRI减影图与。盐水(A类)或带AMPH的SCH23390与。含AMPH的盐水(B类).

**图6。**
SPION-5ECdsAP1的结合特异性（4 mg Fe/kg或12 nmol dsAP1/kg，i.p./i.c.v.注射）。A类)均匀升高*R（右）*₂*SPION-5ECdsAP1在交付前（Pre）以及交付后2小时和4小时测得的值。B类,C类)全染色下TEM在血管周围间隙检测到EDN(B类)以及局部染色(C类). 面板中的实心箭头B类（左图）表示EDN在膜上传输；断开的箭头表示裸露的EDN；星号表示由膜包裹的EDN。面板中的箭头C类inset表示工件的END。D类)C57black6小鼠对SPION-5ECdsAP1的代表性适体摄取(n个=每个2个；面板1和2)或SPION-5ECdsAP1或SPION-5 ECdsNF-*千字节*在双转基因A-FOS突变小鼠中(n个=3; 面板三和4)表示为Δ*R（右）*₂*地图；根据图5所示的结果计算增加量*A.电气*)纹状体中SPION-5ECdsAP1的信号增加，如面板所示*D类；*该ROI在面板中定义*答：。*纹状体Δ的差异*R（右）*₂*面板的*第3页*SPION-5ECdsRan高于基线水平不显著。

**图7。**
细胞内TF蛋白的分子MRI机制。A类)纳米粒子dsDNA适配体的3个主要成分：短dsDNA适配体、亲和素-生物素连接或直接连接、MR造影剂或显微镜试剂。B类)DNA介导的纳米颗粒摄取的拟议内吞途径。C类)一旦内化，DNA适配体与TF蛋白结合，纳米粒子就留在表达TF蛋白的独特细胞内。*C1–C3*)目标绑定后的潜在应用程序。D类)如果dsDNA不与TF蛋白结合，纳米颗粒将被排除在细胞外，并且无法获得图像数据（图6D类3). 当剂量足以竞争细胞内TF蛋白时，可阻止TF蛋白的调节(*C3类*).

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