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.2013年11月；13（11）：3010-20。
doi:10.1111/ajt.12433。 Epub 2013年9月18日。

用于移植的人类同种抗原反应调节性T细胞的临床级制造

A L普特南 1, N萨芬尼亚, 医学博士, 拉兹科夫斯卡, M Wray公司, M A明茨, E特罗塔, G L Szot公司, W刘, A Lares公司, K Lee公司, A Laing公司, R I勒克勒, J L莱利, J A Bluestone公司, G伦巴第, Q唐
附属公司

用于移植的人类同种抗原反应调节性T细胞的临床级制造

A L普特南等。 美国移植杂志. 2013年11月.

摘要

调节性T细胞（Treg）疗法有可能诱导移植耐受，从而将免疫抑制和相关发病率降至最低。与多克隆扩增Tregs（PolyTregs）相比，异抗原反应Tregs在小鼠模型中更有效地防止移植物排斥反应。我们开发了一种制造工艺，使用符合良好制造规范的试剂在短期培养中扩展人类arTreg。该过程使用CD40L激活的异基因B细胞选择性扩增arTregs，然后进行多克隆再刺激以提高产量。Tregs扩增100至1600倍是高度同种异体抗原反应，并表达稳定的Tregs表型。异体抗原扩增的Tregs有不同的TCR曲目。它们在体外比PolyTregs更有效，在人源化小鼠模型中更有效地控制体内同种异体移植损伤。

关键词：细胞治疗；临床应用；调节性T细胞；公差诱导。

PubMed免责声明

利益冲突声明

披露

本手稿的作者有利益冲突需要披露，如美国移植杂志JAB和QT是两项调节性T细胞治疗专利的共同发明者。JAB已收到BD Biosciences的试剂和设备，以支持开发调节性T细胞治疗。

数字

图1
图1。CD40L-sBc有效刺激T细胞增殖
比较来自同一供体的（A和B）PBMC和CD40L-sBc在单向MLR中刺激同种反应性T细胞增殖的能力。MLR前用CFSE标记应答者PBMC，第4天采集培养物进行流式细胞术分析。CD4的典型CFSE稀释曲线+和CD8+T细胞（A）和CD4+福克斯3+HELIOS公司+图中显示了Tregs（B）。这些数据代表了至少10个独立实验。（C） 比较具有不同程度HLA失配的自体CD40L-sBc和异基因CD40L-s Bc与应答细胞刺激CD4增殖的能力+Tconv，CD8型+T细胞和Treg细胞。每个符号代表相同的响应者。结果15种不同刺激器和应答器组合的面积总结。CD40L-sBc、CD40L-刺激的B细胞；羧基荧光素琥珀酰酯；MLR，混合淋巴细胞反应；外周血单个核细胞；Tconv，常规CD4+T细胞；Treg，调节性T细胞。
图2
图2。利用K-CD40L细胞产生CD40L-sBc
（A） 在10天的培养中显示纯化的B细胞的扩增。箭头指示重新模拟的时间。（B和C）使用流式细胞术比较新鲜分离的B细胞和第10天CD40L-sBc中HLA-DR、CD80和CD86的表达。样本叠加直方图如（B）所示，图表总结了独立实验的结果如（C）所示。数据是六个独立实验的总结。CD40L-sBc、CD40L-刺激的B细胞；K-CD40L、CD40L表达细胞系；KT64.CD40升。HLADR0401；MFI，平均荧光强度。
图3
图3。使用CD40L-sBc选择性扩增arTregs
（A） 在第0天和第9天，使用异基因sBc刺激FACS纯化的Tregs。在六个独立实验中，显示了Treg在14天培养中的折叠扩展。箭头指示重新模拟的时间。（B） 用CD40L-sBc刺激Tregs 9天，然后分离培养物，其中一半用同一供体的CD40L-s Bc重新刺激，另一半用抗CD3和抗CD28涂层珠重新刺激。显示了三种独立配对培养物在第14天的折叠扩展(第页=0.75，Wilcoxon配对有符号秩检验）。（C） 扩增Tregs的同种异体反应性是通过在用相同的用于扩增的CD40L-sBc（粗线）、抗CD3和抗CD28涂层珠（细线）或同基因CD40L-s Bc（阴影直方图）重新刺激前用CFSE标记扩增Treg来确定的。（D和E）主要刺激后第9天（D）和第11天（E）出现Treg培养物。数据表示来自至少10种独立文化的结果。（F） 用CD40L-sBc刺激Tregs 9或11天，然后用抗CD3和抗CD28涂层珠重新刺激。在重新刺激5天后收获培养物，并比较三对培养物的总折叠扩张(第页=0.25，Wilcoxon配对签名秩检验）。（G） 用CD40L-sBc刺激Tregs 11天，然后用Invitrogen（开放符号）或Miltenyi Biotec（封闭符号）的抗CD3和抗CD28涂层珠重新刺激。显示了三种配对培养物中细胞随时间的膨胀。采用Wilcoxon配对符号秩检验比较第16天总折叠扩张的差异(第页= 0.25). （H） XY散点图显示了arTreg扩增与不同CD40L-sBc制剂上表达的HLA-DR、CD80和CD86的平均荧光强度（MFI）的相关性。这些数据是11种独立arTreg培养基的摘要。arTregs、arTreg、同种抗原反应Tregs；CD40L-sBc、CD40L-刺激的B细胞；CFSE，羧基荧光素琥珀酰亚胺酯；荧光活化细胞分选；Tregs，调节性T细胞。
图4
图4。使用高通量TCRβ链测序进行Treg TCR储备分析
（A） 使用xy散点图比较Tregs在初次CD40L-sBc（Allo）刺激（x轴）或CD40L-s Bc（Allo）刺激和抗CD3/28珠（Poly）再刺激（y轴）后TCRβ链的使用情况，显示两个样本之间85%的相似性。每个圆圈代表一个独特的TCRβ链核苷酸序列，x轴和y轴上的数据点出现在一个样本中，但在另一个样本上没有。数据代表两个独立实验的结果。（B） 使用xy散点图比较Tregs在初次CD40L-sBc刺激和抗CD3/CD28珠再刺激（x轴）后以及在两轮同种异体抗原刺激（y轴）后TCRβ链的使用情况，显示两个样本之间93%的相似性。数据代表两个独立实验的结果。（C） 从一个供体纯化的Tregs被分成两个相等的部分，并用来自两个不同异基因B细胞供体（Allo和Third party）的CD40L-sBc进行初级刺激，然后进行多克隆再刺激。两种arTreg制剂的TCRβ链用法比较显示，重叠率为2%。相似的CD40L-sBc、CD40L-刺激的B细胞；Treg，调节性T细胞。
图5
图5。表型、同种抗原反应性和在体外用CD40L-sBc扩增Tregs的功能
（A和B）流式细胞术检测未经修饰的（A）和CD4门控的（B）Treg培养物。数据代表了至少14个独立实验。（C） 11种独立培养物中去甲基TSDR和FOXP3百分比的相关性。（D） 4小时后arTregs表达IFN-γ在体外刺激。（E） 如图3B所示，在第11天通过原代异基因sBc刺激和多克隆再刺激扩大Tregs的同种异体反应性。显示了叠加直方图的示例。（F） 如（C）所述，对七种独立文化进行了分析。每个符号代表一种独立的Treg文化。（G） 以下内容的摘要在体外图中显示了Tregs通过两轮异基因CD40L-sBc刺激（闭合圆，Allo-a，n=3）、异基因sBc初级刺激后多克隆再刺激（开放圆，Allo-p，n=8）或两轮多克隆刺激（开放方形，Poly，n=5）扩大的抑制。应答者是Treg供体的PBMC，刺激者是sBc供体的PBMC。所示数据是在三到八个独立实验中观察到的平均值±SEM抑制。采用双向方差分析（ANOVA）和Bonferroni多重比较检验确定差异的统计显著性。不同Tregs组在1:5比例下的抑制作用没有显著差异。与Allo-a Tregs相比，PolyTregs的抑制作用显著降低(第页1:25比例下<0.001，且第页<0.01（1:125比例），或与Allo-p Tregs相比(第页1:25比例下<0.0001，以及第页<0.001，比例为1:125）。Allo-a和Allo-p Tregs在所有比率上都没有显著差异。（H） 显示了CD40L-sBc对sBc供体（闭合圈）或第三方供体（开放三角形）PBMC刺激的Tregs的抑制作用。所示数据是在六个独立实验中观察到的平均值±SEM抑制。采用双向方差分析和Bonferroni多重比较检验确定差异的统计显著性。受sBc和第三方供体刺激的1:1和1:3比率抑制没有显著差异。与第三方供体相比，以1:9和1:27的比例由sBc供体刺激的抑制显著降低(第页在1:9的比例下<0.001，以及第页<0.001，比例为1:27）。arTregs、arTreg、同种抗原反应Tregs；CD40L-sBc、CD40L-刺激的B细胞；羧基荧光素琥珀酰酯；干扰素γ；外周血单个核细胞；PolyTregs，多克隆扩增Tregs；Tconv，常规CD4+T细胞；Tregs，调节性T细胞；TSDR，Treg-特异性去甲基区。
图6
图6。PolyTregs和arTregs对同种异体皮肤损伤的抑制作用体内在一个人性化的小鼠模型中
BALB/c.图2−/−γc−/−用人皮肤移植小鼠，并用PBMC异基因重组到皮肤供体。（A） 实验结束时测定了PBMC的重建，表明联合输注Tregs不会显著改变PBMC重建的程度。（B） BALB/c.Rag2的体重−/−γc−/−对四个实验组的小鼠进行评估，以确定总体健康状况，证明PBMC输注不会诱发GvHD。（C–F）使用三色免疫荧光显微镜评估皮肤移植损伤，并显示具有代表性的结果。（G） 通过计算每个移植体的每个染色点的四至六个高倍视野来分析免疫荧光显微图像。然后比较四个实验组的定量结果。采用Kruskal–Wallis检验和Dunn多重比较后验的单向方差分析来确定差异的统计显著性(*第页<0.05时**第页<0.01, ***第页<0.001). arTregs、arTreg、同种抗原反应Tregs；GvHD，移植物抗宿主病；外周血单个核细胞；PolyTregs，多克隆扩增Tregs；Tregs，调节性T细胞。
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