The twist box domain is required for Twist1-induced prostate cancer metastasis

doi:10.1158/1541-7786.MCR-13-0218-T

.2013年11月；11(11):1387-400.

doi:10.1158/1541-7786.MCR-13-0218-T。 Epub 2013年8月27日。

Twist1诱导的前列腺癌转移需要twist-box域

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PMID： 23982216
预防性维修识别码：项目经理3833995
内政部： 10.1158/1541-7786.MCR-13-0218-T

Twist1诱导的前列腺癌转移需要twist-box域

拉金德拉·P·加朱拉等。摩尔癌症研究. 2013年11月.

.2013年11月；11(11):1387-400.

doi:10.1158/1541-7786.MCR-13-0218-T。 Epub 2013年8月27日。

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¹美国马里兰州巴尔的摩市奥尔良街1550号西德尼·金梅尔综合癌症中心放射肿瘤学和分子放射科学系，邮编21231。tranp@jhmi.edu。

PMID： 23982216
预防性维修识别码：项目经理3833995
内政部： 10.1158/1541-7786.MCR-13-0218-T

摘要

Twist1是一种基本的螺旋-环-螺旋转录因子，在发育过程中起着关键作用，是促进肿瘤转移的上皮-间充质转化（EMT）的主要调节因子。Twist1与癌症相关表型的结构-功能关系未被充分认识，因此我们研究了前列腺癌转移表型对保守Twist-box结构域的需求。有证据表明，Twist1在临床标本中过度表达，并与侵袭性/转移性疾病相关。因此，我们使用体外试验检测了前列腺癌细胞中的反式激活突变体Twist1-F191G，该突变体模拟了不同的转移阶段。基于生物物理单细胞测量，Twist1的过度表达导致细胞迁移边缘的细胞骨架硬度和细胞牵引力升高。Twist1赋予了与癌细胞转移相关的其他细胞特性，包括增加迁移、侵袭、抗失巢凋亡和凤尾鱼非依赖性生长。Twist-box突变体在体外对这些Twist1表型有缺陷。重要的是，我们使用实验性肺转移分析在体内观察到Twist1诱导的肺转移瘤和胸外转移的高频率。前列腺癌细胞定植转移性肺病变和胸外转移瘤需要使用扭箱。比较基因组分析显示，由Twist box引导的转录程序与癌症进展相关，如Hoxa9。Twist1与Hoxa9启动子结合，在前列腺癌细胞中正向调节Hoxa9的表达。最后，Hoxa9对Twist1诱导的与转移相关的细胞表型很重要。这些数据表明Twist-box域是Twist1转录程序和前列腺癌转移所必需的。

启示：靶向Twist1的Twist-box结构域可能有效限制前列腺癌转移潜能。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突：作者声明没有利益冲突。

数字

图1
*扭转1*在人类前列腺癌中过度表达，与更具侵袭性和转移性的疾病相关。(一)来自14个独立微阵列数据集的人类前列腺癌样本（n=700）与正常前列腺样本（n=313）的比较*扭转1*使用Oncomine表达。热图包含个别研究（11-23）。热图强度对应于百分位过度表达（红色）或抑制（蓝色）。所有14个数据集的中位数排名表明*扭转1*在人类前列腺癌中过度表达，第页=0.002. (b条)从（a）中分析研究#2（11）表明*扭转1*过度表达与转移性疾病相关，第页<0.000001. (**c（c）**)我们通过对初级人类前列腺样本进行qPCR来验证该微阵列分析*扭转1。扭转1*与正常前列腺（n=24）相比，人类前列腺癌（n=107）中的mRNA过度表达，第页<0.0001，通过Mann-Whitney t检验。(d日)数据分析来自(**c（c）**)格利森得分显示*扭转1*过度表达与Gleason评分增加相关，第页<0.0001，使用单向方差分析。

图2
Twist-box突变体缺乏Twist1转录活性，在前列腺癌细胞中显示EMT细胞标记物减弱。(一)所检测的Twist1蛋白结构和191位苯丙氨酸位点特异性突变的示意图（此示意图未按比例绘制）。扭曲框L-187、F-191和R-195中转录转录激活所需的关键功能残基以绿色显示。我们创建了过度表达Twist1-F191G突变体的构建物，该突变体用苯丙氨酸-191替代甘氨酸。**（b）**Twist1启动子报告分析表明，Twist1-F191G突变体的转录活性有缺陷。用萤火虫荧光素酶相关的人类E-cadherin基因表达载体瞬时转染Myc-CaP细胞(*CDH1型*)启动子结构与a雷尼利亚荧光素酶报告载体转染效率标准化。36小时后，对细胞提取物进行荧光素酶和*雷尼利亚*活动并显示*扭转1*过表达抑制了E-cadherin基因启动子的转录，但Twist1-F191G突变体因该功能而减弱（***-p<0.001，通过Mann-Whitney试验）。使用SLUG基因进行了类似的报告分析(*SNAI2公司*)启动子构建，表明Twist1-F191G突变与野生型Twist1过度表达相比，没有进行私有转录的能力（***-p<0.001，通过Mann-Whitney检验）。每个条形图代表一式三份进行的五到六个独立实验的值。条形代表柱平均值；误差棒±SEM。Western blot分析Twist1在(**c（c）**)Myc-CaP（左面板）和PC3（右面板）细胞稳定表达Vector并过度表达类似水平的Twist1或Twist1-F191G，β-actin用作负荷控制。上皮和间充质标记物也通过(**c（c）**)蛋白质印迹和(d日)Myc-CaP（左面板）和PC3（右面板）细胞中Twist1、E-cadherin、ZO-1和Vimentin的免疫荧光。

图3
Twist1过表达诱导前列腺癌细胞迁移过程中活细胞骨架（CSK）材料特性的时空变化。**（a）**伤口划伤后24小时Myc-CaP细胞的代表性亮场图像。使用磁扭转细胞术（MTC），刚度g’(b条)和损耗模量g“(**c（c）**)在生理频率范围内测量(*（f）*). 开放和闭合方块代表Myc-CaP过度表达Twist1细胞的g'和g“。开环和闭环代表矢量控制单元的g'和g“。这些线是实验数据与结构阻尼方程的拟合，并添加了前面描述的牛顿粘性项（28）。通过非线性回归分析进行拟合。颜色表示迁移前端的各个细胞层（如所示一). 数据显示为中位数（1^标准图层：矢量n=73，扭曲1 n=77；2^第图层：矢量n=119，扭曲1 n=168:3^第个图层：矢量n=101，扭曲1 n=87；4^第个图层：矢量n=44，扭曲1 n=64）。(d日)表达Myc-CaP细胞的Vector和Twist1的刚度在0.75 Hz、划伤后（T，0小时）和24小时后进行探测。数据表示为几何平均值+SE（矢量：T 0 hr n=169，T 24 hr n=337；扭曲1:T 0 hr n=240，T 24 hrn=396）。(**e（电子）**)表达Vector和Twist的Myc-CaP细胞划痕后24小时细胞刚度的空间分布[数据以中值表示，与(b条)]. (f）在Myc-CaP等基因细胞系中进行划痕伤口愈合试验，并在0小时和24小时显示典型图像。**（g）**相对伤口闭合度由归一化为初始伤口面积的剩余伤口面积计算得出（n=3,3场；*-第页通过ImageJ软件（NIH）进行的Mann-Whitney试验表明，过度表达Twist1-F191细胞的Myc-CaP细胞迁移性低于野生型Twist1细胞。(小时)Twist1过度表达增加了基质上单个前列腺癌细胞的牵引力，而Twist-box突变Twist1-F191G减弱了这种牵引力。使用傅里叶变换牵引显微镜（FTTM）测量单个细胞（n=20-21）的细胞牵引力。顶部面板显示了Myc-CaP等基因细胞系的典型相位对比图像。底部面板显示牵引图；单元格内的颜色表示以帕斯卡为单位的牵引的绝对大小，箭头表示相对大小和方向。(我)Twist1过度表达增加了条形图格式中显示的投影面积的平均值，而Twist-box突变的等基因细胞系因该表型而减弱。(j个)Twist1过度表达会增加单个活细胞施加的细胞牵引力或净收缩力矩，而Twist1-F191G突变体对此功能完全缺乏。条形代表柱平均值；误差条为±SEM。通过Mann-Whitney检验，这些值是显著的：*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; 和***，第页<0.001.

图4
Twist-box突变体在Twist-1诱导的侵袭、抗失巢凋亡和软琼脂致瘤性方面存在缺陷。用Matrigel进行Transwell侵袭试验，结果为等基因(一)Myc-CaP（n=7）和(b条)PC3细胞（n=6）。允许Myc-CaP细胞侵袭24小时，PC3细胞侵袭60小时。Twist1过表达增加了Myc-CaP和PC3细胞对Matrigel的侵袭，但Twist1-F191G突变赋予这些细胞较小的侵袭能力（用柱平均值±SEM表示，*-第页<0.05（通过Mann-Whitney试验）。使用超低附着培养皿贴壁或悬浮培养细胞。通过AnnexinV-AlexaFluor 488和碘化丙啶染色，然后进行流式细胞术分析，对超低附着条件下的凋亡细胞死亡或失活进行定量。的代表性点图(**c（c）**)Myc-CaP和(**e（电子）**)显示PC3 Twist1等基因细胞系。象限II（早期凋亡）和象限III（晚期凋亡）中构成凋亡部分的细胞百分比以粗体显示。通过将超低附着条件下的总凋亡分数归一化为粘附细胞的凋亡分数来计算凋亡百分比，并绘制为条形图±SEM(d日)Myc-CaP（n=8）和(f）PC3（n=6）扭曲1等基因细胞系（*，第页<0.05；和**，第页<0.01（学生）t吨-测试）。5×10⁵细胞包埋在软琼脂中，培养2周。在至少5个随机字段中对含有50个以上细胞的菌落进行评分。代表性相位对比图像(克)Myc-CaP和(我)显示了40倍放大倍数的PC3 Twist1等基因细胞系。通过将菌落数归一化为细胞总数来计算软琼脂中的克隆原性百分比，并用条形图±SEM表示(小时)Myc-CaP（n=6）和(j）PC3（n=6）（*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; 和***，第页<0.001（通过Mann-Whitney试验）。

图5
Twist1过表达赋予Myc-CaP前列腺癌细胞转移能力体内这取决于扭曲框域。用Myc-CaP Twist1等基因细胞系进行实验性肺转移检测。5 × 10⁵将细胞尾静脉注射到8周龄裸鼠体内，4周后处死，观察肺定植和胸外转移。每个细胞系使用4-6只小鼠组成的队列，并进行三次实验。(一)肺部肿瘤的代表性尸检照片，用黑色箭头区分。(b条)三种等基因细胞系定植肺部肿瘤能力的比较表体内来自(一). Twist1过度表达的Myc-CaP细胞能够形成肉眼可见的肺部肿瘤体内在小鼠中的频率（10/18或55.6%）远高于病媒控制细胞（2/17或11.8%；第页通过Fisher精确检验=0.0116）。Twist1盒突变型Myc-CaP细胞具有中间表型体内（4/12或33.3%的小鼠；第页=0.198与Vector和第页=0.2839，与Fisher精确测试的野生型Twist1相比）。(**c（c）**)来自(一)插图显示肺部肿瘤的放大视图。(d日)注射Twist1等基因细胞的小鼠胸外转移的代表性尸检照片，转移用黑色箭头表示。这些胸外转移是前列腺癌细胞在尾静脉注射后发生完全转移的结果。(**e（电子）**)三种等基因Myc-CaP细胞系形成胸外转移的能力比较表(d日). Twist1过度表达使Myc-CaP细胞在小鼠体内形成胸外转移的频率（11/18或61.1%）高于载体控制细胞（1/17或5.9%）和Twist1-box突变过度表达细胞（2/12或16.7%；第页=0.0009，扭曲1与矢量和第页=0.0256（捻度1相对于捻度1-F191G，通过费希尔精确测试）。(**（f）**)Twist1诱导胸外转移的典型H&E图像，插图显示放大图像。(克)注射Myc-CaP+载体细胞（左）或Myc-CaP+Twist1细胞（右）的小鼠尾静脉分离的肺的代表性抗Myc免疫组织化学图像。肺部肿瘤（未显示胸外转移）c-Myc染色阳性，证实肿瘤细胞为Myc-CaP细胞。

图6
Twist1框结构域中的突变极大地减弱了Myc-CaP前列腺癌细胞中Twist1global基因表达谱。**（a）**通过微阵列对稳定表达Vector、Twist1（WT）和Twist1-F191G的Myc-CaP细胞的基因表达分析显示，与Twist1-F191G突变细胞和Vector对照细胞相比，Twist-1过表达细胞和Ventor对照细胞之间差异表达的基因组更大。各组之间的基因表达通过经验贝叶斯调节方差分析进行，如果在Benjamini-Hochberg FDR后B>0，则认为基因表达存在差异。(b）表达Vector、Twist1（WT）和Twist-1-F191G的Myc-CaP细胞基因表达的监督聚类分析的热图可视化显示，Twist1-box突变株Twist1-F191G具有与Vector控制细胞更相似的基因表达谱。每列代表一个Myc-CaP微阵列样本，每行代表一个基因的以中位数为中心的表达值。高表达用绿色表示，中间表达用黑色表示，低表达用红色表示(**c（c）**)从精心策划的分子特征数据库中选择的基因集代表性过高(第页<0.05，单向Fisher精确检验，Benjamini-Hochberg FDR）在一组由Twist1而非Twist1-F191G差异调节的基因中，如本研究所示，这些基因与过度表达Twist1-与Twist-1-F191G的前列腺癌细胞之间的表型差异有关（绿色表示相对过表达，红色表示相对抑制）。Twist1而非Twist1-F191G过度表达导致*霍克萨9*/*HOXA9型*过度表达(d日)Myc-CaP和(**e（电子）**)PC3细胞。(**（f）**)的启动子区示意图*霍克萨9*带有包含区域（ER）的电子盒。Twist1和Twist1-F191G通过ChIP-qPCR与ER4和ER5结合。倒置三角形是E-box序列，箭头表示每个ER两侧的qPCR寡核苷酸集。*-表示第页与Vector相比<0.05；和#-表示第页与扭转1相比，<0.05。(克)Myc-CaP和PC3前列腺癌细胞中Twist1和Twist-box突变体的表型总结。T-Twist1、F-Twist1-F191G突变和V-Vector控制。

图7
*霍克萨9*是Twist1诱导Myc-CaP细胞迁移、侵袭、抗失巢凋亡和软琼脂致瘤性所必需的。(a）用shRNA构建物转导稳定过度表达Twist1的Myc-CaP细胞*霍克萨9*或由确定的加扰控制和相对表达式*霍克萨9*qPCR（左侧面板，n≥3）和Hoxa9 Western blotting（右侧面板）。(b）Myc-CaP+Twist1等基因细胞系的划痕伤口愈合试验以及0-小时和48-小时显示的代表性图像。**（c）**相对伤口闭合计算（如图3所示；所有n=3，3场）。(d日)用Matrigel对等基因Myc-CaP+Twist1细胞进行Transwell侵袭试验（n=6，用柱平均值±SEM表示）。(**e（电子）**)使用超低附着培养皿贴壁或悬浮培养细胞，并通过AnnexinV-AlexaFluor 488和碘化丙啶染色（如图4所示）量化失巢蛋白，绘制条形图±SEM。5X10⁵细胞包埋在软琼脂中，培养2周。在至少5个随机字段中对含有50个以上细胞的菌落进行评分。(**（f）**)显示了40倍放大率的典型相位对比图像。(克)通过将菌落数归一化为细胞总数来计算软琼脂中的克隆原性百分比，并用柱状图±SEM表示（n≥4）。所有比较，*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; 和***，第页经Mann-Whitney检验<0.001。

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