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。2013年9月15日；126（第18部分）：4085-98。
doi:10.1242/jcs.118596。 Epub 2013年7月10日。

骨膜和小梁骨成骨细胞中的Bmp2将骨形成与血管化和间充质干细胞联系起来

吴晨阳（Wuchen Yang） 1, 郭大勇, 玛丽·A·哈里斯, 崔勇（音）, 杰丽卡·格卢哈克·海因里奇, 吴俊杰, 陈晓东, 查尔斯·斯金纳, 杰弗里·奈曼, 詹姆斯·R·爱德华兹, 格雷戈里·曼迪, 亚历克斯·利希特勒, 芭芭拉·克雷姆, 大卫·W·罗, 伊沃·卡拉齐奇, 瓦尔·戴维, Darryl L Quarles公司, 德米特里·维拉雷尔, 格里格·司考特, 玛纳斯·雷, S刘, 詹姆斯·F·马丁, Yuji Mishina公司, 斯蒂芬·E·哈里斯
附属机构

骨膜和小梁骨成骨细胞中的Bmp2将骨形成与血管化和间充质干细胞联系起来

杨戊辰等。 细胞科学杂志。 。

摘要

我们使用3.6Col1a1-Cre转基因模型生成了一个新的Bmp2条件敲除等位基因，该等位基因没有从成骨细胞中移除Bmp2基因的新盒（Bmp2-cKO（ob））。Bmp2-cKO（ob）小鼠的骨骼更薄，脆性增加。成骨细胞活性降低，表现为成骨率降低，无法分化为成熟矿化阶段。成骨细胞中的Bmp2也间接控制骨膜和骨髓中的血管生成。Bmp2-cKO（ob）成骨细胞中的VegfA生成减少。成骨细胞中Bmp2的缺失也会导致间充质干细胞（MSCs）缺陷，这与骨膜和小梁骨中微血管床的减少有关。体内几种MSC标记基因（α-SMA、CD146和血管生成素-1）的表达、体外CFU测定以及α-SMA（+）MSC中Bmp2的缺失支持了我们的结论。Bmp2在成骨细胞和MSCs中的关键作用是骨形成、血管化和间充质干细胞之间的重要联系。

关键词：血管生成；Bmp2；间充质干细胞；成骨细胞；VegfA；α-SMA+细胞。

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数字

图1。
图1。
成骨细胞选择性Bmp2型骨膜和小梁区缺失。（A）现场第5天和第1个月股骨杂交（蓝色）。OB，成骨细胞。对每个年龄段的两个独立婴儿进行评估，每个婴儿的股骨切片为2-3张，每张切片为2-3幅照片。（B） Bmp2蛋白表达的免疫细胞化学。OB，骨表面的成骨细胞。从1个月大的两只独立幼崽的股骨上取2–3个切片进行评估，每个切片有多张图像。（C） 对照组和Bmp2-cKO组4个月和1年时的手臂和下脊柱X线照片对象老鼠。对200多只不同年龄的幼崽进行了评估，并显示了具有代表性的X光片。（D） 来自4个月龄对照组和Bmp2-cKO的椎骨小梁区和骨膜的BFR对象动物。小梁（顶部）和骨膜（底部）的高分辨率图像。两窝独立的对照和Bmp2-cKO对象对动物进行评估，并显示相对MS/BS和BFR率。结果为平均值±标准偏差。比例尺：20 微米（A、B）；10 毫米（C）；40 µm（D）。
图2。
图2。
脊椎的μCT分析、脊椎和长骨的BMD分析以及对照组和Bmp2-cKO的股骨力学测试对象动物。（A） μCT显示Bmp2 cKO对象椎骨有开放的腹侧突（黄色箭头），尺寸减小，总骨体积与总体积之比减小。分析是用n个 = 5只对照动物或Bmp2-cKO对象基因型。（B） BMD在Bmp2-cKO中降低对象从2周到8个月的时间里，对脊椎和长骨进行了检测。分析是在n个 = 每个年龄段有3-6只两种基因型的动物。（C） 三点弯曲断裂表示Bmp2-cKO对象小鼠刚度降低，易断裂，屈服后韧性显著降低。分析是在n个 = 每个基因型6–11只小鼠，4个月大。结果为平均值±标准偏差。比例尺：1 mm。
图3。
图3。
对照组和Bmp2-cKO中Osterix、Col1a1和Osteocalcin的组织学和组织形态计量学分析及表达对象。（A） 用苏木精复染Trap染色的组织学，以评估成骨细胞和破骨细胞。蓝色箭头表示成骨细胞。在Bmp2 cKO中对象模型中，成骨细胞大多扁平，OB减少。S/BS（成骨细胞表面到骨表面）。对每只动物的三只独立幼崽进行定量组织形态计量学分析，每只幼崽有2-3个切片和2-3个不同区域的图像。（B）成骨相关转录因子抗体,第1a1列和原位骨钙素5日龄对照组和Bmp2-cKO的股骨杂交对象动物。对每种基因型的两窝幼崽进行评估，每个骨骼的2–3个切片和2–3张不同区域的图像。橙色虚线勾勒出骨骼表面；BV，血管；BM，骨髓；OB，成骨细胞；Ocy，骨细胞。比例尺：20µm。
图4。
图4。
Bmp2-cKO中的血管缺陷对象模型。（A） 4月龄小鼠的胫骨与对照组和Bmp2-cKO中Col1V水平的免疫染色和定量对象动物。对一窝幼崽进行2–3个截面的评估，每个年龄段每个胫骨的截面上有两个不同的区域。（B） 使用材料和方法（David等人，2009）中描述的方法绘制小梁血管的三维血管图。7个月时，测量股骨的血管体积与骨髓体积（骨干）和每骨小梁体积（干骺端）的BV的关系。对每种基因型的三个独立窝进行评估。（C） 三维血管图和骨膜血管量化，Bmp2-cKO中血管与总体积、血管表面与骨表面和血管数量与骨表面的比值减少对象7个月时，以股骨为单位。对每个基因型的三个独立窝进行评估。（D） 小微血管（<15 直径µm）在Bmp2-cKO的干骺端显著减少对象而在7个月龄时，干骺端和骨干区的大血管受影响较小。数据是三胎婴儿的平均值±标准差。比例尺：100 微米（A）；1 毫米（B、C）。
图5。
图5。
素食者协会mRNA和蛋白表达水平降低，Bmp2-cKO中的血管生成素1蛋白水平也降低对象老鼠。（A）现场1月龄对照组和Bmp2-cKO股骨小梁骨成骨细胞中VegfA表达的杂交对象动物。对三只独立的幼崽进行了评估，每个基因型的每只骨骼有两个切片和三个切片图像。在4个月大的动物股骨中观察到类似结果（数据未显示）。（B） 对照组和Bmp2-cKO组5天龄时胫骨小梁区的VegfA蛋白免疫细胞化学对象动物。对每种基因型的两个独立幼崽进行评估，平均值为每只动物2–3个不同截面的多个独立区域图像的测量值。右侧图像中的黑色区域是组织切片中的伪影折叠。图表显示平均值±标准偏差比例尺：20 微米（A）；100 微米（B）。
图6。
图6。
α-SMA、CD146和血管生成素-1免疫细胞化学及CFU-F和CFU-Ob测定在体外来自对照、杂合子和Bmp2-cKO对象动物。（A） 1.5个月大对照WT和Bmp2-cKO胫骨切片中的α-SMA免疫反应性对象动物。小梁区，顶部；骨膜区，底部。带OB的黄色箭头表示α-SMA水平较低。α-SMA随着成骨细胞的成熟而减少（Kalajzic等人，2008）。黑色箭头表示树枝状α-SMA+与血管无关的细胞；红色箭头，α-SMA血管相关细胞+.对两个独立的幼崽和每个骨骼的三个切片进行评估。（B） 对照组和Bmp2-cKO中CD146蛋白水平和α-SMA–樱桃报告水平对象1个月时胫骨区域，通过ImageJ分析估计信号。黄色箭头表示内皮细胞。红色箭头，红色血细胞。黄色箭头，CD146+或αSMA+细胞。对每只动物3至5个切片的三窝独立幼崽进行了评估。（C） 血管生成素1免疫细胞化学显示1个月大时胫骨（顶部）和骨髓（底部）的小梁区，以及1个月龄对照组和Bmp2-cKO的单位面积红细胞数量估计对象动物。对每种基因型的两只幼崽和每骨2-3个切片进行评估。黄色箭头表示Ang1+骨髓中的细胞。（D） 来自Control-WT、Control-Het和Bmp2-cKO的BMSC培养物的CFU-F克隆水平（左）和CFU-OB水平（右）对象4个月大的动物，n个 = 3.整个分析重复两次，结果相似，并显示了一个具有代表性的实验。图表显示平均值±标准偏差比例尺：50 微米（A）；30 微米（B）；50 µm（C，顶部）；20 µm（C，底部）；1 厘米（D）。
图7。
图7。
富集α-SMA+BMSC对VegfA的反应和内源性需求Bmp2型这些干细胞分化为矿化成骨细胞的基因。（A） BMSC的FACS分析在XC-marrowECM上展开，左侧为对照IgG–FITC，中间为α-SMA IgG-FITC。右侧面板为北部分析Bmp2型α-SMA扩增polyA RNA的表达+经100次治疗的骨髓间充质干细胞 ng/ml素食。（B） 不含和含100的矿物结构 纳克/毫升rBmp2。α-SMA对照培养物和rBmp2处理培养物的暗场（顶部）、相控（中部）和VonKossa/VanGieson染色（底部）+骨髓间充质干细胞在分化试验前感染了Ad5–GFP或Ad5–Cre。红色箭头，控制一般结构。黄色箭头，rBMP2处理的矿物结构。对，来自两个独立培养物的矿化结构量化（ImageJ），每个井测量6到8个40×场。比例尺：100 µm（顶部和底部）；20 µm（中间）。（C） 北方分析Bmp2型,成骨相关转录因子抗体/Sp7公司,第1a1列,骨钙素,深度mp1和素食者协会α-SMA中含有或不含有rBmp2的1天和8天培养物扩增的polyA RNA中的mRNA+骨髓间充质干细胞先前用Ad5–GFP或Ad5–Cre治疗。Northern分析显示来自一个具有代表性的实验，使用α-SMA重复了三次实验+BMSC公司Bmp2型外汇/外汇细胞系统用于矿化分析，两次用于northern基因表达分析。
图8。
图8。
模型描述了成骨细胞生成的Bmp2与VegfA生成和增加的微血管化的关系，作为间充质干细胞的主要生态位。来自成骨细胞的Bmp2（Bmp2对象)以自分泌或细胞自主的方式刺激成骨细胞分化，产生VegfA对象并增加Bmp2对象蛋白质。素食者协会对象与血管生成素1联合刺激新的稳定微血管结构和相关的血管间充质干细胞。Bmp2型对象刺激Bmp2表达（Bmp2理学硕士)相关MSC以旁分泌方式诱导其分化为成熟成骨细胞。内皮细胞可能是Bmp2型Bmp2和其他BMP在骨髓环境中诱导的表达以及内皮细胞或内皮细胞前体中BMP信号的增加可能通过类似于异位骨化病理学中观察到的机制，以生理方式促进新MSCs的形成（Medici和Olsen，2012）。首先，我们建议Bmp2对象刺激内源性Bmp2理学硕士在脑内或非常规分泌机制（USM）途径中共同驱动MSC向成骨细胞分化途径。VegfA有助于MSCs向成熟成骨细胞的这种谱系承诺（Liu等人，2012）。
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