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.2013年5月21日；110（21）：E1943-52。
doi:10.1073/pnas.1216203110。 Epub 2013年4月26日。

Nogo-A是中枢神经系统血管生成的负调节因子

托马斯·瓦尔切利 1, 文森特·佩内, 奥利弗·温曼, 饶业绍, 安娜·古兹克·科纳卡, 纪尧姆·德雷伊, 丹尼斯·尤克塞尔, 汉娜·施耐德, 约翰尼斯·沃格尔, 唐纳德·英格勃, 维奥拉·沃格尔, 卡尔·弗雷, 马丁·施瓦布
附属公司

Nogo-A是中枢神经系统血管生成的负调节因子

托马斯·瓦尔切利等。 美国国家科学院程序. .

摘要

Nogo-A是成人和发育中的中枢神经系统中一种重要的轴突生长抑制剂。在体外，Nogo-A已被证明可以抑制神经元和非神经元细胞类型的迁移和细胞扩散。在这里，我们研究了Nogo-A在出生后早期脑和视网膜血管生成过程中对血管内皮细胞的体内和体外作用，Nogo-A在这些脑和视网膜中由多种类型的神经元表达。基因消融或病毒介导的Nogo-A敲除或用抗体中和Nogo-A导致体内血管密度显著增加。在培养基中，Nogo-A以剂量依赖性的方式抑制原代脑微血管内皮细胞（MVEC）的扩散、迁移和萌发，并诱导MVEC跛足和丝状足的回缩。从机制上讲，我们表明只有Nogo-A特异的Delta 20结构域对MVEC具有抑制作用，但Nogo-66片段（Nogo-A-、-B和-C共同的抑制结构域）没有。此外，Nogo-A Delta 20对MVEC的作用需要Ras同源基因家族成员A（Rho-A）相关的、含有线圈的蛋白激酶（ROCK）-肌球蛋白II途径的细胞内激活。抗Nogo-A抗体显著减轻了出生后早期脑膜或培养神经元对MVEC的抑制作用。这些发现确定Nogo-A是中枢神经系统发育血管生成的重要负调控因子。它们可能在涉及血管生成的CNS病理学中具有重要意义，如中风、脑肿瘤和视网膜病变。

关键词：发展神经科学；内皮尖端细胞；神经血管联系。

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利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
血管及其内皮尖端细胞生长在出生后大脑中含有Nogo-A的组织中。对P4和P8小鼠大脑的冠状切片（40µm）进行Nogo-A[Laura抗体（21），绿色]、血管内皮细胞标记物IB4（红色）和一般核标记物DAPI（蓝色）染色。(A类–C类)出生后大脑中的血管（红色）生长在P4皮层富含Nogo-A（绿色）的CNS组织中(A类)和第8页(B类). 中的装箱区域B类在中放大C类显示IB4附近的Nogo-A表达（绿色）+P8小鼠皮层血管（红色）。IB4中未检测到Nogo-A+血管。(D类)使用识别Nogo-a和Nogo-B共同N末端的兔抗血清进行Western blot【Bianca抗体（21）】。在P8脑膜提取物和PC12细胞中检测到Nogo-A和-B，但在P8脑源性MVEC中未检测到。GAPDH被用作负荷控制（每车道50µg蛋白质）。(E类)Nogo-A（绿色）在IB4标记的内皮尖端细胞及其P8皮质中的丝状体（红色）附近高度表达。右侧的方框区域被放大。(F类)三维共焦图像z（z）-P8皮质中被Nogo-a（绿色）包围的皮质IB4标记内皮尖端细胞（红色）的叠加投影。箭头表示IB4+但是Nogo-A−内皮尖端细胞丝足。(G公司和H（H）)P8小鼠脑的冠状切片（40µm）用抗PDGFRβ（绿色）染色周细胞，用抗GFAP（蓝色）染色星形胶质细胞，用血管内皮细胞标记物IB4（红色）染色。(G公司)PDGFRβ+周细胞部分覆盖IB4+内皮细胞，而GFAP+星形胶质细胞在IB4附近表达+内皮细胞。(H（H）)在P8皮质中，PDGFRβ+周细胞（绿色）部分包围IB4+内皮尖端细胞（红色），不包括丝状突起。（比例尺：200μm inA类和B类，100µm英寸C类，10μm英寸E类，50μm英寸G公司和10μm英寸H（H）.)
图2。
图2。
Nogo-A基因缺失或抗体中和导致血管组织密度增加，并导致出生后大脑皮质内皮尖端细胞数量增加。(A类–D类)带IB4的皮层+P8 WT小鼠的血管(A类)Nogo-A公司−/−老鼠(B类)和注射对照抗体的小鼠(C类)，或使用抗Nogo-A抗体(D类). 无功能Nogo-A的小鼠(B类和D类)IB4密度较高+血管比对照动物(A类和C类). (E类–H（H）)利用体视学定量P8皮层血管组织密度(E类)，海马体(F类)，上丘(G公司)和胼胝体(H（H）). P8 Nogo-A的组织血管密度明显较高−/−小鼠和注射抗Nogo-A抗体的P8 WT小鼠比注射同种对照抗体的P8WT小鼠(n个= 4). (我)注射AAV8.sh.RNA-Nogo-A-GFP的P8小鼠皮层神经元中GFP的表达（绿色）。注射AAV8.sh.RNA-GFP的P8小鼠皮层中未观察到Nogo-A下调。(J型和K（K）)IB4的密度+注射AAV8.sh.RNA-Nogo-A-GFP的动物皮层血管增多(K（K）)与注射AAV8.sh.RNA-GFP的对照动物大脑皮层相比(J型). (L（左）)通过体视学对P8皮层血管组织密度进行量化。注射AAV8.sh.RNA-Nogo-A-GFP的小鼠组织血管密度显著高于注射AAV8.4h.RNA-GFP的WT小鼠或小鼠(n个=3）。(M（M）)一个IB4+P8时小鼠皮层中的血管内皮尖端细胞（共焦图像z（z）-叠加最大强度投影）。值得注意的是，许多丝状突起从内皮细胞尖端细胞体中出现。(N个和O（运行）)P4-Nogo-A皮质中内皮尖端细胞的数量显著增加−/−老鼠(N个)和P8 Nogo-A−/−注射抗Nogo-A的小鼠和P8小鼠(O（运行）)与WT小鼠或注射对照抗体的小鼠相比(N个和O（运行）) (n个=3）。所有数据均显示为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001. （比例尺：500µm inA类–D类,上部; 100µm英寸A类–D类、下部、，J型和K（K）; 50µm英寸我; 和10µm英寸M（M）).
图3。
图3。
Nogo-A消融或中和导致出生后视网膜血管组织密度增加。(A类和B类)通过视网膜冷冻切片的免疫组织化学，在βIII-管蛋白中观察到Nogo-A（绿色）+IB4附近的神经元（蓝色）+P4时小鼠视网膜中的血管（红色）和血管内皮尖端细胞。(C类)显示表面发展的方案(上部，蓝色）和深(下部，红色）P4和P8的视网膜血管层。箭头指示视网膜中血管内皮（尖端）细胞迁移的方向。(D类)与P4视网膜相比，P8视网膜切片（箭头）的内网状层中Nogo-A的免疫荧光信号降低(A类)但在光纤层仍保持较高水平。FL，光纤层；IPL，内丛状层；RGCL，视网膜神经节细胞层；RL，视网膜母细胞层。(E类和F类)IB4染色的P4视网膜浅血管层的迁移前沿在Nogo-A中更为先进−/−与WT对照组动物相比。(G公司和H（H）)血管移行前锋与视神经头的径向距离(G公司)视网膜血管覆盖面积的百分比(H（H）)Nogo-A的P4视网膜显著增加−/−与WT对照组相比的动物（平均值±SEM，n个= 4–5). (我–K（K）)视网膜深部血管（IB4+)在P8 WT小鼠中(我)Nogo-A公司−/−老鼠(J型)和用对照抗体治疗的小鼠(K（K）)或使用抗Nogo-A抗体(L（左）). 白色虚线我–L上部标记视网膜边界。(M（M）)P8 Nogo-A视网膜深血管层组织血管密度−/−注射抗Nogo-A抗体的小鼠和P8 WT小鼠的视网膜比注射同型对照抗体的P8野生小鼠或P8野生鼠的视网膜显著增加(n个= 4–7). 所有数据显示为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001. （比例尺：100µm inA类; 25µm英寸B类; 100μm英寸D类;10μm英寸D类,插入; 500μm英寸E类和F类; 100µm英寸我–L（左）.)
图4。
图4。
Nogo-A Delta 20抑制MVEC的粘附和扩散，并对MVEC跛足足和丝状足产生快速的不稳定作用。(A类)在涂布了浓度增加的Nogo-A Delta 20的培养皿上，MVEC的扩散和粘附性降低。在涂有Nogo-A Delta 21的培养皿上没有观察到对MVEC扩散和粘附的抑制。(B类和C类)MVEC传播(B类)和粘附力(C类)在涂有Nogo-A Delta 20的培养皿上，剂量依赖性降低，但在涂有诺果-A Delta21的培养皿中，剂量依赖型降低。(D类)F-actin（被指骨样蛋白染色）在生长在涂有Nogo-A Delta 20的培养皿上的MVEC中失去了其细长结构。DAPI染色为蓝色。(E类和F类)纳米柱结构(E类)和DiI-染色的P8 MVEC（红色）(F类)在纳米柱基板上（蓝色）。(G公司–N个)Nogo-A Delta 20诱导MVEC跛足回缩的时间进程(H（H）和我)随后丝状伪足回缩(我和J型)用Nogo-A Delta 21处理的MVEC在20分钟到1小时内仅表现出轻微的形状变化(L（左）–N个). 四帧电影S3(G公司–J型)和，共电影S5(K（K）–N个)如图所示。中的装箱区域G公司和K（K）在中依次放大H（H）–J型和中L（左）–N个分别是。(O（运行）)Nogo-a Delta 20诱导的单个MVEC丝状体收缩导致单个纳米柱（黑色方块）弯曲。这三种颜色（蓝色、绿色和粉色）表示丝状足附着、弯曲和分离的三个完整周期。经Nogo-A Delta 21（白色方块）处理的MVEC丝状体仅显示附着纳米柱的微小净位移或牵引力。所示数据为三个复制实验的平均值±SEM(n个= 3). **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001, ****P（P）< 0.0001. （比例尺：100µm inA类; 20µm英寸D类; 2µm英寸E类; 10μm英寸F类,G公司、和K（K）; 和5μm英寸H（H）–J型和L（左）–N个.)
图5。
图5。
Nogo-A Delta 20抑制微血管内皮细胞迁移和发芽。(A类)用于研究MVEC细胞迁移的Transwell系统方案。(B类)经趋化性（VEGF-a）和结合趋化性梯度（纤维连接蛋白，FN）刺激后，MVEC迁移显著增加。(C类)随着Nogo-A Delta 20浓度的增加，MVEC迁移呈剂量依赖性减少。注意Nogo-A Delta 21的轻微抑制活性。数据显示为平均值±SEM(n个= 3–6). (D类–F类)在含有VEGF-a和碱性FGF（bFGF）的3D纤维蛋白凝胶中形成MVEC芽(D类)在存在Nogo-A德尔塔20（1µM）的情况下几乎被废除(E类)但Nogo-A Delta 21（1µM）没有(F类). (G公司–我)添加Nogo-A Delta 20后，MVEC发芽率显著降低。数据显示为平均值±SEM(n个=3个实验；在每个实验中针对每个条件测定至少25个珠子）。(J型和K（K）)在脑源性MVEC与表达Nogo-A的神经元PC12细胞的共培养中，PKH26标记的MVEC（红色）在PKH67染色的PC12细胞（绿色）周围形成抑制区(J型). 抑制区减少，两种细胞类型在中和抗Nogo-A抗体存在下混合(K（K）). (我)在存在抗Nogo-A抗体（11C7）或使用Ad.sh-RNA-Nogo-A-病毒下调Nogo-A.时，MVEC在PC12细胞周围形成的抑制区明显较少。数据显示为平均值±SEM(n个=3）。(M（M）)遇到PKH26染色的MVEC（红色）和PKH67染色的PC12细胞（绿色）从镀液滴迁移过来的迁移前沿。右侧的方框区域被放大。注意，形成了一个清晰分离的界面。(N个和O（运行）)抗Nogo-A抗体的存在显著降低了Nogo-A-介导的MVEC和PC12细胞分离，如P（P）MVEC和PC12细胞的混合物。数据显示为平均值±SEM(n个=4-5个实验；根据条件和实验评估两种或三种培养物）*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001, ****P（P）< 0.0001. （比例尺：100μm inD类–F类; 20μm英寸J型和K（K）; 1000μ，左侧; 200µm英寸M（M）,赖特; 和20μm英寸N个和O（运行）.)
图6。
图6。
Nogo-66不抑制微血管内皮细胞粘附、迁移或肌动蛋白细胞骨架动力学。(A类)使用兔抗NgR1和兔抗Lingo1抗体进行Western blot。在P8和成人脑膜提取物中检测到NgR1和Lingo1，但在P8及成人脑源性MVEC中未检测到。GAPDH用作负荷控制（每条车道25µg蛋白质）。(B类)NgR1（绿色）在IB4标记的内皮尖端细胞及其P8皮质中的丝状突起（红色）附近表达。注意点状NgR1标签。箭头表示IB4+而NgR1阴性内皮尖端细胞丝足。(C类)将DiI-标记的MVEC添加到纳米柱基底上。MVEC在由纳米柱组成的基底上的扩散并没有减少，纳米柱涂有越来越高浓度的Nogo-66。(D类)MVEC在Nogo-66涂层纳米柱上产生的位移和牵引力没有降低，与纤维连接蛋白涂层纳米柱的位移和牵引力相当。在10分钟的时间内，对每种情况下与三个单独MVEC接触的纳米柱进行测量。数据显示为每组三个单个MVEC的平均值±SEM(n个=3）。(E类–G公司)三帧电影S9如图所示。Nogo-66（1µM）在1小时内未引起MVEC跛足和丝状足回缩。MVEC形状的微小变化反映了MVEC突起的探索行为。中的装箱区域E类放大F类和G公司. (H（H）)对于使用Nogo-66（1µM）处理的MVEC，单个MVEC丝状体仅对附着的纳米柱施加较小的净位移和牵引力。(我)随着Nogo-66浓度的增加，未观察到MVEC迁移受到抑制。数据显示为三个复制实验的平均值±SEM(n个=3）。（比例尺：10µm inB类,C类、和E类; 5μm英寸F类和G公司.)
图7。
图7。
Nogo-A Delta 20对脑微血管内皮细胞扩散的抑制作用可以通过阻断Rho-A-ROCK-肌球蛋白II通路来抵消。(A类)MVEC在由涂有Nogo-a Delta 20（100 pmol/cm2). (B类–E类)用2µM C3转移酶阻滞剂治疗Rho(B类)，含20µM Y27632的岩石(C类)，MLCK与25µM ML-7(D类)和肌球蛋白II ATP酶与30µM Blebbistatin(E类)抵消Nogo-A Delta 20对MVEC传播的抑制作用。(F类)用阻断剂C3转移酶、Y27632、ML-7和Blebbistatin处理的MVEC在涂有Nogo-A Delta 20的纳米柱上产生的位移和牵引力增加到与未处理的MVEC在涂有Nogo-A Delta 21的纳米柱上产生的位移和牵引力相似的水平（见图S6). 在10分钟的时间内，对每种情况下与三个单独MVEC接触的纳米柱进行测量****P（P）< 0.0001. 数据显示为每组三个单一MVEC的平均值±SEM(n个=3）。(G公司和H（H）)对于用C3转移酶或Y27632治疗的MVEC(G公司)，或使用ML-7或Blebbistatin(H（H）)单个MVEC丝状体仅对附着的纳米柱施加较小的净位移和牵引力。数据显示为三个复制实验的平均值±SEM(n个=3）。（比例尺：10µm）
图P1。
图P1。
(A类)在出生后的小鼠中枢神经系统中，新生血管侵入含有膜蛋白Nogo-a（绿色）的组织，该蛋白以限制神经突起生长而闻名。在发育的这个阶段，Nogo-A主要由神经元表达，为CNS内皮（尖端）细胞的迁移和萌发提供抑制信号，从而限制血管密度。(B类)在大脑的各个区域以及视网膜中，Nogo-A（绿色）的基因缺失（Nogo-A-KO）或抗体介导的中和（黑色）导致功能性血管（红色）的组织密度增加。以出生后的小鼠前脑皮层为例。
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