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。2013年4月17日；8（4）：e61834。
doi:10.1371/journal.pone.0061834。 2013年印刷。

CD9/CD81四spanin复合物和CD151四spanin通过重叠但不同的机制调节α3β1整合素依赖的肿瘤细胞行为

伊丽莎白·古斯塔夫森·瓦格纳 1, 克里斯托弗·斯蒂普
附属公司

CD9/CD81四spanin复合物和CD151四spanin通过重叠但不同的机制调节α3β1整合素依赖的肿瘤细胞行为

伊丽莎白·古斯塔夫森·瓦格纳等。 公共科学图书馆一号。 。

摘要

整合素α3β1能有效促进其配体层粘连蛋白332和层粘连素511上的细胞运动，这可能有助于解释为什么α3βl反复与乳腺癌的进展和转移有关。α3β1的亲迁移功能强烈依赖于与细胞表面四spanin蛋白的横向相互作用。四spanin CD151直接与α3整合素亚单位相互作用，并将α3β1整合素连接到其他四spanin，包括CD9和CD81。CD151的缺失破坏了α3β1与其他四spanins的结合，并损害了α3α1依赖性运动。然而，除CD151外的四spanins在多大程度上需要特定的α3β1功能尚不清楚。为了阐明α3β1功能的哪些方面需要哪些四spanins，我们通过RNA干扰创建了CD9和CD81均缺失的乳腺癌细胞。为了揭示它们对α3β1功能的贡献，需要沉默这两种密切相关的四跨蛋白。然后我们直接比较CD9/CD81增强细胞和CD151增强细胞。CD9/CD81增强细胞和CD151增强细胞均显示延迟的α3β1依赖细胞在层粘连蛋白332上扩散。然而，令人惊讶的是，一旦完全扩散，CD9/CD81增强细胞（而不是CD151增强细胞）显示出受损的α3β1依赖性定向运动和改变的前额细胞形态。同样出乎意料的是，在乳腺癌细胞中促进α3β1与PKCα的关联需要CD9/CD81复合物，而不是CD151，PKC抑制剂模拟了CD9/CD81-silenced细胞运动缺陷的某些方面。我们的数据揭示了特异性四跨肽对α3β1整合素功能的重叠但令人惊讶的不同贡献。重要的是，CD9/CD81的一些α3β1调节功能可能不需要CD9/CD81CD151与α3βl物理连接。

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利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。CD9/CD81缺失MDA-MB-231的细胞扩散和定向迁移受损。
(A类)将MDA-MB-231野生型、CD9/CD81si、CD9RX和CD81RX细胞接种在LM-332涂层的玻璃盖玻片上，30分钟后通过相差显微镜对细胞扩散进行成像。(B类)每种细胞类型的细胞铺展面积是通过从铺展30分钟后细胞的平均面积中减去电镀后立即成像的细胞平均面积来计算的。数值为平均值±标准误差。；n个 = 3次试验，每次试验每种细胞类型至少25个细胞*P<0.01（CD9/CD81si vs.WT，CD9RX和CD81RX，方差分析与Tukey后测）。(C–E类)MDA-MB-231野生型、CD9/CD81si、CD9RX或CD81RX细胞被镀在LM-332上，允许其附着并完全扩散，然后通过延时显微镜监测3小时的净行程(C类)，偏移速度(D类)、和持久性(E类)使用ImageJ测量。数值为平均值±标准误差。；n个 = 9个试验（WT和CD9/CD81si细胞）或4个试验（CD9RX和CD81RX细胞），每个试验有25-50个细胞。与野生型相比，CD9/CD81si的迁移参数显著降低（*P<0.05），CD9RX(#P<0.10）和CD81RX(&P<0.01）细胞，方差分析与Tukey后测。(F类)图表显示了每种类型25个细胞在3小时内从原点开始的运动轨迹。
图2
图2。CD9/CD81-silenced细胞的前区细胞形态改变。
(A类)在LM-332上迁移的野生型MDA-MB-231细胞经常在细胞后部出现长突起（白色箭头），这在CD9/CD81si细胞中不太常见。(B类)对野生型、CD9/CD81si、CD9RX和CD81RX细胞在3小时视频中每细胞持续4分钟或更长时间的突起数量进行量化。数值为平均值±标准误差。；n个 = 3个试验，25个细胞/试验。CD9/CD81si细胞的尾部明显少于野生型（*P<0.01）或CD81RX细胞(&P<0.01）；CD9RX细胞的尾巴也比野生型少一些(#P<0.01），方差分析与Tukey后验。(C类)在每种细胞类型中形成的后部突起尾部的总持续时间。数值为平均值±标准误差。；n个 = 3个试验，25个细胞/试验。CD9/CD81si细胞尾部持续时间显著低于野生型（*P<0.05）和CD81RX(#P<0.05）。(D类)MDA-MB-231野生型和CD9/CD81si细胞的Cortactin和Phalloidin染色。细胞被贴在LM-332涂层的盖玻片上1h，然后固定、渗透，并用抗结核菌素抗体（绿色）和阴茎倍肽染色，以显示F-actin（红色）。覆盖面板中的方框区域显示为缩放的感兴趣区域（R.O.I.）。覆盖面板中两个代表性细胞的前缘绘制的线用于皮质素染色（绿色痕迹）和F-actin染色（红色痕迹）的像素强度扫描，以任意单位绘制。强度扫描从细胞外部进入细胞内部，并从左到右绘制图形。
图3
图3。CD151促进α3整合素-CD9的结合，是LM-332上正常粘附和初始细胞铺展所必需的。
(A类)将MDA-MB-231野生型、CD9/CD81si和CD151si细胞在1%Brij 96V/Brij 99（两种洗涤剂的1∶1混合物）中进行裂解，并对CD9、CD81、CD151或α3整合素进行免疫沉淀（IP），然后对α3整合素亚基进行印迹。注意，α3整合素-CD9结合在CD151诱导的细胞中几乎完全消失，但α3-CD151结合在CD9/CD81诱导的细胞内保持不变。(B类)将野生型、CD9/CD81si和CD151si MDA-MB-231细胞镀于涂有LM-332、I型胶原（COLI）或BSA的微孔中30分钟。去除非粘附细胞，并固定剩余细胞，用结晶紫染色进行定量。数值为平均值±标准误差。；n个 = 4口井/单元类型。CD151si细胞与LM-332的粘附性不如野生型或CD9/CD81si细胞好（*P<0.001），Tukey后测方差分析。(C类)将野生型、CD9/CD81si和CD151si细胞镀在LM-332涂层的盖玻片上，并在45分钟后固定。如图1B所示，测量细胞扩散面积。每种类型的代表细胞都用白色勾勒出来，以强调扩散区域的差异。图中数值为平均值±标准误差。；n个 = 3次试验，每次试验每种类型至少25个细胞。CD9/CD81si和CD151si细胞的扩散面积小于野生型细胞（*P<0.001），CD151si的细胞扩散面积小于CD9/CD81 si细胞扩散面积(#P<0.001），方差分析与Tukey后验。(D类)野生型、CD9/CD81si和CD151si细胞在I型胶原涂层盖玻片上的扩散没有显著差异。
图4
图4。CD151缺失不会影响LM-332上MDA-MB-231细胞的迁移。
MDA-MB-231野生型、CD9/CD81si或CD151si细胞被镀在LM-332或I型胶原涂层的玻璃底皿上。细胞附着和扩散后，通过延时显微镜监测运动，如图1所示。(A类)与野生型细胞相比，CD9/CD81si细胞（而非CD151si细胞）在LM-332上的迁移速度降低（*P<0.01）。(B类)与野生型细胞相比，CD9/CD81si细胞（而非CD151si细胞）在LM-332上的定向持久性降低（*P<0.01）。(C类)与野生型细胞相比，CD9/CD81si细胞（而非CD151si细胞）在LM-332上的净行程减少（*P<0.001）。对于A–C，所示值为平均值±s.e.m。；n个 = 12个试验（野生型）、9个试验（CD9/CD81si）和3个试验（CD151si），每个试验至少有25个细胞。数据通过方差分析和Dunnett的后验进行分析。(D–F型)野生型、CD9/CD81si和CD151si细胞对胶原I的运动性。CD151si细胞的迁移速度和净移动距离显著大于野生型细胞（*P<0.01，Dunnett后检验的ANOVA）。CD9/CD81si细胞运动参数与野生型无差异。在一次试验中，每种类型的25个细胞的数值均为平均值±标准偏差。(G公司)野生型和CD151si细胞在LM-332上显示出相似数量的后部突起。图中数值为平均值±标准误差。；n个 = 3个试验，每个试验每种类型25个细胞。
图5
图5。CD9/CD81复合物促进MDA-MB-231细胞在3D Matrigel中的长期生长。
(A类)将MDA-MB-231野生型、CD9/CD81si和CD151si细胞悬浮在生长因子减少的Matrigel中，分别使用20×、10×和4×物镜在7、28和35天的时间点进行成像。(B类)平均菌落生长是通过使用ImageJ软件测量每个时间点20-34个菌落的总面积来计算的。条形图表明，在28和35天的时间点，CD9/CD81si菌落（而非CD151si菌落）的平均值±标准偏差显著小于野生型菌落（*P<0.01，Dunnett后检验方差分析）。
图6
图6。CD9/CD81促进PKCα-α3β1整合素结合，PKCα促进α3β1-依赖性MDA-MB-231细胞运动。
(A类)用100 nM PMA处理MDA-MB-231野生型、CD9/CD81si和CD151si细胞30 min，然后在1%Brij 99洗涤剂中溶解，然后进行CD9、CD151、α3整合素或CD55免疫沉淀和免疫印迹检测PKCα。(B、 C类)对每种细胞类型的裂解液进行PKCα和β-肌动蛋白免疫印迹。(D类)如材料和方法所述，通过LiCOR红外荧光印迹成像评估每种细胞类型中与PKCα相关的细胞总α3整合素的比例。条形图表示至少3种不同斑点/细胞类型的平均值±S.E.M。CD9/CD81si细胞与其他两种细胞类型相比，α3整合素相关PKCα显著降低（*P<0.05，**P<0.01，方差分析与Tukey后验）。(E–G公司)将野生型MDA-MB-231细胞接种在LM-332涂层的玻璃底皿上，并在添加PKC抑制剂Gö6976（1µM）之前和之后的3 h通过延时显微镜监测运动。存在Gö6976时，迁移速度和净移动距离均显著降低（*P<0.0001，未配对t检验）。图中数值为Gö6976之前75个单元格和Gö676之后70个单元格的平均值±标准偏差。
图7
图7。CD9/CD81复合物与PKCα-α3β1整合素结合的假设机制。
(A类)CD9/CD81可能间接调节PKCα-α3β1的结合，例如通过隔离干扰PKC与α3β1.相互作用能力的因子X。(B类)当CD9/CD81耗尽时，因子X可能被释放以阻断PKC-整合素关联。(C类)当CD151耗尽时，CD9/CD81与α3β1的关联被破坏，但因子X仍被隔离，使PKC继续与α3α1关联。(D类)不同的CD9/CD81池可能独立于CD151作为PKC与α3β1的直接连接物。(E类)当CD9/CD81耗尽时，尽管CD151仍与α3β1相关，但连接功能被破坏。(F类)当CD151耗尽时，大部分CD9/CD81从α3β1复合物中丢失，但剩下的足以将PKCα连接到α3β1。
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