Characterization of induced neural progenitors from skin fibroblasts by a novel combination of defined factors

doi:10.1038/srep01345

.2013:3:1345.

doi:10.1038/srep01345。

通过新的特定因子组合鉴定皮肤成纤维细胞诱导的神经前体细胞

田长海¹, 刘强（音）, 马康木, 王永祥, Qiang Chen（陈强）, 兰德尔·安布罗兹, 大卫·L·克林盖尔, 李玉菊, 黄云龙, 丁建清, 吴杰, 嘉林C郑

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通过新的特定因子组合鉴定皮肤成纤维细胞诱导的神经前体细胞

长海田等。科学代表. 2013.

.2013:3:1345.

doi:10.1038/srep01345。

作者

长海田¹, 刘强（音）, 马康木, 王永祥, Qiang Chen（陈强）, 兰德尔·安布罗兹, 大卫·L·克林盖尔, 李玉菊, 黄云龙, 丁建清, 吴杰, 嘉林C郑

附属

¹同济大学医学院附属上海第十人民医院转化神经变性与再生治疗中心，上海200072。ctian@unmc.edu

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摘要

最近的报告表明，体细胞可以通过一系列转录因子的异位表达直接转化为其他分化细胞类型，从而直接避免通过多潜能状态的转化。我们之前的实验通过五种转录因子（Sox2、Brn2、TLX、Bmi1和c-Myc）的新组合产生诱导的神经前体样细胞（iNPC）。在这里，我们证明了iNPC不仅具有NPC特异性标记基因，而且具有原代脑源性NPC（WT NPC）的性质，包括三帐篷分化潜能、成熟神经元分化能力和突触形成。重要的是，来自iNPC的成熟神经元具有重要的生理特性，例如钾通道活性和动作电位样尖峰的产生。这些结果表明，直接重新编程的iNPC与WT-NPC非常相似，这可能意味着一种替代策略，可以克服诱导神经元（iNC）有限的增殖和谱系潜能，并拓宽细胞治疗在神经退行性疾病治疗中的应用。

PubMed免责声明

数字

**图1。iNPC、WT-NPC和Fbb的光图像和免疫染色分析。**
对iNPC、WT-NPC和Fbb进行悬浮培养或贴壁培养（涂有聚-D-赖氨酸/纤维粘连蛋白），并通过明亮视野显微镜（右侧）评估细胞形态。电池（5×10⁴)在含有涂有聚-D-赖氨酸/纤维粘连蛋白的盖玻片的24孔板中培养，用4%PFA固定，用0.2%Triton X-100在PBS中渗透，然后用Nestin（红色）、Sox2和Pax6（绿色）抗体进行免疫染色，用DAPI（蓝色）进行核染色（左面板）。（比例尺：50 微米）。

**图2。iNPC中神经前体细胞标记基因的表达及其分化潜能。**
（A）使用基于SYBR-Green的定量RT-PCR和特定引物对分析iNPC、Fbb和WT-NPC中NPC特异基因的转录谱（见表1）。误差条对应于SEM。（B）通过基于SYBR Green的定量RT-PCR和特异性引物对分析Fbb、iNPC和WT NPC中成纤维细胞特异性基因的表达水平（见表1）。GAPDH被用作内部控制。（C）培养在IV型胶原涂层盖玻片上的iNPC分别在神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化条件下孵育，然后用多克隆β-微管蛋白III（上面板）、单克隆GFAP（中面板）和多克隆O4（下面板）抗体进行免疫染色，并用DAPI（蓝色）进行核染色（比例尺：50 微米）。

**图3。来自iNPC的神经元之间的成熟神经元分化和突触形成。**
iNPC在IV型胶原涂层玻璃盖玻片上培养，并进行亚型神经元分化。分化三周后，用4%的PFA和（A）固定细胞，然后用β-微管蛋白III和MAP-2（上面板）、β-微管蛋白III和TH1（中面板）以及β-微微管蛋白II和GAD67（下面板）进行双重免疫染色。（B） β-微管蛋白III和突触体素抗体双重免疫染色。（a，a′）β-微管蛋白III（绿色）；（b，b′）突触体素（红色）；（d，d′）表示（c，c′）的放大倍数，箭头表示神经元之间形成突触。DAPI核染色（蓝色）。（比例尺：50 微米）。

**图4。通过全细胞斑贴灯记录评估iNPC衍生神经元的电生理特性。**
贴在培养的iNPC分化神经元（A）膜上的贴片吸管的相位对比图。（B）之前和（C）之后电流注入步骤诱导的动作电位样尖峰的典型痕迹1 μM TTX处理。（D） A型K⁺电流是由初始超极化引起的（从−60的保持电势开始的电压阶跃毫伏至-90 mV并返回到−60 mV（第一步），然后逐步到+30 mV，增量为10 毫伏（500 ms持续时间） mM茶。（E） D型K⁺电流是由初始去极化引起的（电压阶跃从−60的保持电位开始毫伏至−30 mV并返回到−60 mV（第一步），然后逐步到+30 mV，增量为10 毫伏（500 ms持续时间） mM 4-氨基吡啶。条形图显示了iNPC衍生神经元的静息膜电位（F）和膜电容（G）。（比例尺：50 微米）。

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