Engineering a lysosomal enzyme with a derivative of receptor-binding domain of apoE enables delivery across the blood-brain barrier

doi:10.1073/pnas.1222742110

.2013年2月19日；110（8）：2999-3004。

doi:10.1073/pnas.1222742110。 Epub 2013年2月4日。

利用载脂蛋白E受体结合域的衍生物构建溶酶体酶，使其能够通过血脑屏障传递

王大仁（Daren Wang）¹, 萨利姆·塞勒·阿穆里, 梅代, 恰伊宽, 大卫·Y·惠, 罗斯科·O·布雷迪, 《刀盘》

附属公司

PMID： 23382178
预防性维修识别码：项目经理3581871
内政部： 10.1073/pnas.1222742110

利用载脂蛋白E受体结合域的衍生物构建溶酶体酶，使其能够通过血脑屏障传递

王大仁（Daren Wang）等。美国国家科学院程序. 2013.

.2013年2月19日；110(8):2999-3004.

doi:10.1073/pnas.1222742110。 Epub 2013年2月4日。

作者

王大仁（Daren Wang）¹, 萨利姆·塞勒·阿穆里, 梅代, 恰伊宽, 大卫·Y·惠, 罗斯科·O·布雷迪, 《刀盘》

附属

¹美国俄亥俄州辛辛那提市辛辛那蒂儿童医院医学中心实验血液学和癌症生物学科，邮编：45229。

PMID： 23382178
预防性维修识别码：项目经理3581871
内政部： 10.1073/pnas.1222742110

摘要

为了实现大分子量物质治疗神经系统疾病的潜力，需要新的方法来克服血脑屏障（BBB）。我们研究了载脂蛋白E（apoE）的受体结合肽与潜在治疗蛋白的融合能否与BBB上的LDL受体结合并转染到中枢神经系统。溶酶体酶α-L-iduronidase（IDUA）用于I型粘多糖病（MPS）小鼠模型的生物学和治疗评估，MPS是最常见的伴有中枢神经系统缺陷的溶酶体储存障碍之一。我们通过体外筛选确定了两种融合候选物，IDUAe1和IDUAe2，它们表现出理想的受体介导的结合、内吞作用和跨内皮转运，以及适当的溶酶体酶运输和生物功能。瞬时肝脏表达产生的强大外周IDUAe1或IDUAe2导致毛细血管衰竭、酶缺乏的脑组织中酶水平升高，并在治疗后2天内将蛋白质输送至非内皮血管周细胞、神经元和星形胶质细胞。此外，长期给予成熟红细胞产生的中等水平的IDUAe1 5个月后，MPS I小鼠获得了2%至3%的正常脑IDUA活性，并且在整个大脑的神经元和星形胶质细胞中检测到IDUAe1protein。中度但持续递送IDUAe1后5个月，MPS I小鼠的脑糖胺聚糖和β-己糖胺酶正常化，证明了其治疗潜力。这些发现提供了一种非侵入性和BBB靶向的程序，用于输送大分子治疗剂，以治疗神经溶酶体储存障碍和可能涉及大脑的其他疾病。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。**
工程化IDUA蛋白在转基因细胞系中引入LRP1介导的内吞作用。(A类)修饰人IDUA蛋白（hIDUA）与myc-tag和载脂蛋白B或载脂蛋白E（apoE*）的受体结合域融合在框架内的示意图。箭头表示由HpaI（标记为“H”）、ClaI（“C”）、XhoI（“X”）或聚链接体（星号）的限制位点编码的空间链接体。(B类)改性IDUA释放形式的表位结合和催化活性。用小鼠抗myc单克隆抗体沉淀含有不同IDUA-Rb且具有IDUA活性的培养基（开条）。使用免疫沉淀珠测定IDUA活性（实心棒）。数据来源于两个实验，每个实验均采用重复的IDUA分析进行三次IP反应。(C类)摄入抑制试验。首席人事官^LDL阴性-LRP1细胞与含有类似IDUA-Rb活性的培养基（500 U/mL）一起培养，该培养基含有或不含有M6P或RAP抑制剂。数据来自于在重复井中进行的两个或三个独立实验。(D类)选定IDUA-Rb候选物的结合/内化分析。首席人事官^LDL阴性-LRP1细胞在4°C下暴露于各种IDUA-Rb（500 U/mL），有或无不同抑制剂，然后在37°C新鲜培养基中培养。在重复的井中进行了两个独立的实验。(E类)比较缺失（MEF-LRP1阴性）或过度表达LRP1受体（MEF-LRP1）的细胞中所选IDUA-Rb的受体结合。细胞在4°C下暴露于有或无RAP抑制剂的IDUA融合蛋白（500 U/mL）。使用兔抗LRP1抗体的细胞裂解液进行IP，然后使用洗涤的免疫珠进行IDUA酶分析。

**图2。**
融合IDUA蛋白使患者成纤维细胞中溶酶体的积聚正常化，并促进LRP1依赖性内皮细胞蛋白的转运。(A类)使用Transwell系统将来自MPS I患者的成纤维细胞（GM00497；Coriell Cell Repositories）与过度表达未修饰IDUA或选择的融合IDUA的HEK293细胞共培养24小时。溶酶体（红色）的LysoTracker免疫荧光染色和细胞核（蓝色）的DAPI免疫荧光染色显示了代表性的显微照片。(B类)牛脑毛细血管内皮细胞在胶原涂层的Transwell嵌件的上腔中培养，然后在4°C暴露于改良的IDUA，然后在37°C新鲜培养基中培养。在不同时间点用IP和抗myc抗体捕获下室的IDUA，并通过酶分析进行定量。数据来自两个或三个具有三个重复微孔的独立实验，并表示为平均值±SEM(**P（P）*与IDUA3′Myc对照组相比<0.05；^#*P（P）*=0.08 vs.不含RAP的摄入）。

**图3。**
循环中的活体生成的IDUA融合蛋白可以运输到CNS，并使MPS I小鼠大脑中GAG的积累正常化。在流体动力注射后2天，从灌流良好的动物中收集整个大脑。(A类)血浆和毛细血管耗竭的脑实质中的酶活性(n个=每组7–9只小鼠）。黑色条表示平均活动。(B类–D类)脑切片免疫荧光染色的代表性图像。样品用IDUA蛋白（绿色）和内皮标记物（CD31；红色）抗体染色(B类)，终末分化神经元标记（NeuN；红色）(C类)或星形胶质细胞标记物（GFAP；红色）(D类). 所有切片用DAPI对细胞核（蓝色）进行复染。（比例尺，10μm）(E类)肝脏生成的IDUA-Rb可减少MPS脑内GAG的积累。N个每根横杆下显示了各组的IDUA活性，IDUA3′Myc组的平均血浆IDUA活度为1771 U/mL，IDUAe1组为808 U/mL和IDUAe2组为456 U/mL(**P（P）*<0.05和***P（P）*<0.001英寸A类和E类).

**图4。**
与红细胞特异性LV转导后，MPS I嵌合体中IDUAe1的长期表达和脑酶升高(A类)血浆IDUA水平。MPS I小鼠在7至8周龄时用MPS Lin移植⁻用LV-KImyc-iG（MPS/KImyc-i G）或LV-KIe1-iG（MPS/KIe1-i G）转导的细胞。正常、杂合的同卵双胞胎；UD，无法检测。数据来自每组5-7只小鼠。(B类)移植后5个月通过实时定量PCR测定骨髓中的转基因频率。每个样品通过两个或三个重复反应的实验进行分析。(C类)大脑IDUA活动。BMT后5个月，从灌流良好的动物中收集整个大脑。N个显示在每个条形图下方。MPS I脑中检测不到IDUA水平（<0.01 U/mg）(***P（P）*= 0.025).

**图5。**
将成熟红细胞产生的外周IDUAe1（而非IDUAmyc）传递给神经元和星形胶质细胞，导致MPS I小鼠大脑中GAG和己糖胺酶正常化。移植用红系特异性LV转导的HSC五个月后，从彻底灌注的动物中采集全脑。(A类和B类)来自大脑皮层的脑切片的免疫荧光染色的代表性图像。样本用myc-tag（绿色）和NeuN（红色）抗体染色A类)或GFAP（红色B类). 所有切片均用DAPI复染细胞核（蓝色）。（比例尺，10μm）箭头表示毛细结构。图中还显示了白色边界内的放大区域(底部面板），突出显示共定位（黄色）。(C类)大脑GAG积累。(D类)脑β-己糖胺酶活性。N个每个栏下都显示了每组的情况。(**P（P）*<0.05和***P（P）*<0.001英寸C类和D类; NS，无显著性）。

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