Characterisation of fibroblast-like synoviocytes from a murine model of joint inflammation

doi:10.1186/ar4158

.2013年1月29日；15（1）：R24。

doi:10.1186/ar4158。

小鼠关节炎症模型中成纤维细胞样滑膜细胞的特征

罗文·S·哈代, 克劳迪娅·胡尔索, 刘英玲, 西尔维亚·J·加斯帕里尼, 科莱特·方烨, 《金文图》, 什哈尼·斯通, 保罗·M·斯图尔特, 卡里姆·拉扎, 马克·S·库珀, 马库斯·塞贝尔, 洪州

PMID： 23363614
预防性维修识别码：项目经理3672796
DOI（操作界面）： 4158年10月186日

小鼠关节炎症模型中成纤维细胞样滑膜细胞的特征

罗文·S·哈代等。关节炎研究与治疗. 2013.

.2013年1月29日；15（1）：R24。

doi:10.1186/ar4158。

作者

PMID： 23363614
预防性维修识别码：项目经理3672796
DOI（操作界面）： 4158年10月186日

摘要

简介：成纤维细胞样滑膜细胞（FLS）在确定炎症性关节疾病的基质环境中发挥着核心作用。尽管越来越多地使用从小鼠炎症模型分离的FLS，但尚未对这些细胞进行详细表征。

方法：在本研究中，从表达T细胞受体转基因KRN和MHC II类分子Ag7（K/BxN小鼠）的小鼠炎症关节中分离出FLS，并通过免疫荧光和实时逆转录聚合酶链反应（real-time RT-PCR）测定其培养纯度。通过实时RT-PCR测定促炎基因的基本表达。用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定分泌的白细胞介素6（IL-6），并用肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和皮质酮（啮齿动物的主要糖皮质激素）相对于其他间充质细胞群测定其调节作用。

结果：通过纤维连接蛋白、脯氨酰4-羟化酶、分化簇90.2（CD90.2）和248（CD248）在98%以上人群中的阳性表达来鉴定FLS培养的纯度。培养的FLS能够通过基质凝胶迁移和侵袭，在TNF-α的存在下这一过程增强。与从非燃烧组织中分离的FLS相比，从K/BxN小鼠中分离出的FLS具有更高的炎症标记物IL-6、趋化因子配体2（CCL-2）和血管细胞粘附分子1（VCAM-1）的基础表达（IL-6，3.6倍；CCL-2，11.2倍；VCAM-1，9倍；P<0.05）。与其他间充质细胞系（K/BxN；IL-6，40.8倍；CCL-2，1343.2倍；VCAM-1，17.8倍；ICAM-1，13.8倍；P<0.05）相比，当皮质酮浓度为100 nmol/l时，K/BxN-FLS中所有炎症标记物的表达均显著增加，且增加幅度更大，分泌的IL-6反映了这些结果（K/BxN；con，169±29.7 vs TNF-α，923±378.8 pg/ml/1×10⁵ 细胞；P<0.05）。剂量反应实验证实，皮质酮的有效浓度在10至100 nmol/l之间，TNF-α的有效浓度为1至10 ng/ml，而FLS中炎症基因的表达在第四代和第七代之间是稳定的。

结论：本研究建立了一组特征明确的关键炎症基因，用于体外FLS培养，从K/BxN小鼠和无火焰野生型对照组中分离。经评估，它们对促炎和抗炎信号的反应与人类FLS培养中的反应非常相似。此外，本研究为小鼠FLS培养物的有效特性、持续时间和治疗提供了指南。

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数字

图1
**FLS培养的验证**.（a）观察到K/BxN（成纤维细胞样滑膜细胞）FLS的融合单层*在体外*放大10倍。**（b）**在一个无火焰对照FLS野生型（WT）、三个K/BxN FLS系（FLS 1至3）、初级颅骨成骨细胞（OBs）和巨噬细胞系RAW 264.7（MΦ）中，通过标准RT-PCR在35个周期测定18S、P4H、CD248、骨钙素（OCN）和CD68的mRNA表达。CD248（蓝色）、CD90.2（品红色）和纤连蛋白（红色）在非炎症FLS中的表达**（c、e、g）**和K/BxN FLS（d、f、h）共聚焦荧光免疫组化检测。**（i）**在存在或不存在TNF-α（ng/ml）的情况下，相对于未经处理的非燃烧对照FLS，经基质涂层的跨腔插入物的FLS侵入。**（j）**家政基因18s钙粘蛋白-11的ΔCt mRNA表达正常。提供的数据来自三个单独的WT对照FLS和三个K/BxN FLS，加载25 ng mRNA用于RT-PCR。对于图1 c-h，所示结果代表了三条单独的K/BxN FLS线。图1b已裁剪，以便呈现多个凝胶。

图2
**滑膜CD248和纤维连接蛋白的表达体内**脱钙石蜡包埋关节切片进行CD248和纤维连接蛋白染色，并用吉尔苏木精复染。在非炎症对照中检查染色**（a、d）**和发炎的K/BxN（b、e）接头。**（c、f）**放大后显示K/BxN关节滑膜发炎。黑色箭头分别表示CD248和纤维连接蛋白阳性染色。棒材=100μm。

图3
**皮质酮和TNF-α对FLS炎症基因的调控**实时RT-PCR测定FLS（成纤维细胞样滑膜细胞）炎症基因mRNA表达的折叠变化。在皮质酮预处理后16小时，测定IL-6、趋化因子配体2（CCL-2）、血管细胞粘附分子1（VCAM-1）和细胞间粘附分子1的mRNA表达**（a-d）**（100 nmol/l）或TNFα**（e-h）**（10 ng/ml）持续24小时。对看家基因18S rRNA水平的数据进行标准化，并显示为相对于未经处理的野生型（WT）对照FLS的表达变化倍数（±标准误差）**P（P）*<0.05时***P（P）*<0.001与各自未经治疗的对照组相比#*P（P）*>0.05与未经处理的WT对照FLS。结果显示为三条独立FLS线和两条WT控制FLS线的组合副本。

图4
**FLS中IL-6的调节**用RT-real-time-PCR对K/BxN小鼠分离的（成纤维细胞样滑膜细胞）FLS进行IL-6 mRNA表达的剂量-反应分析**（a）**皮质酮（0、1、10、100、500、1000 nmol/l）或**（b）**肿瘤坏死因子α（0，0.1，1，5，10，25纳克/毫升）。**（c）**实时RT-PCR测定野生型（WT）对照FLS、C2C12、MC3T3-E1和K/BxN FLS中IL-6 mRNA表达的折叠变化。所有mRNA数据均按看家基因18S rRNA的水平进行了标准化，并呈现为相对于未处理对照组或未处理WT-con-FLS的表达折叠变化（±标准误差）。**（d）**通过特异性ELISA测定白细胞介素-6在WT-con-FLS、C2C12、MC3T3-E1和K/BxN-FLS培养基中的分泌（pg/ml/100000细胞，±标准误差）。在对照组TNFα（10 ng/ml）或皮质酮（100 nmol/l）治疗后16小时收集mRNA和条件培养基**P（P）*<0.05时***P（P）*<0.001与各自未经治疗的对照组相比#*P（P）*与未经处理的WT对照FLS相比，<0.05。剂量反应实验是两个K/BxN FLS的组合重复。所有其他数据均为三条单独FLS线路、两条WT控制FLS线路，两条C2C12重复和两条MC3T3-E1重复的组合副本。

图5
**炎症标记物对长时间培养的调节**通过实时RT-PCR在第2代和第8代（P2至P8）之间测定成纤维细胞样滑膜细胞（FLS）中炎症基因mRNA表达的折叠变化。在16小时时测量mRNA的表达**（a）**IL-6，**（b）**趋化因子配体2（CCL-2），**（c）**血管细胞粘附分子1（VCAM-1）和**（d）**细胞间粘附分子1（ICAM-1）。对每个基因的产品数据进行归一化处理，以获得管家基因18S rRNA的水平，并表示为相对于P2对照的表达变化倍数（±标准误差）**P（P）*与第2段相比，<0.05#*P（P）*与第3段相比，<0.05。显示的结果是两个K/BxN FLS的组合副本。

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