Reproducible method to enrich membrane proteins with high purity and high yield for an LC-MS/MS approach in quantitative membrane proteomics

doi:10.1002/elps.201200503

.2013年3月；34(6):809-17.

doi:10.1002/elps.201200503。 Epub 2013年2月25日。

用于定量膜蛋白质组学的LC-MS/MS方法中高纯度和高收率富集膜蛋白的可重复方法

仙隐莱¹

附属公司

PMID： 23334993
预防性维修识别码：项目经理3749515
内政部： 10.1002/elps.201200503

用于定量膜蛋白质组学的LC-MS/MS方法中高纯度和高收率富集膜蛋白的可重复方法

仙隐莱. 电泳. 2013年3月.

.2013年3月；34(6):809-17.

doi:10.1002/elps.201200503。 Epub 2013年2月25日。

作者

仙隐莱¹

附属

¹印第安纳大学医学院细胞与综合生理学系，印第安纳州印第安纳波利斯，邮编46202。xlai@iupui.edu

PMID： 23334993
预防性维修识别码：项目经理3749515
内政部： 10.1002/elps.201200503

摘要

膜蛋白丰度相对较低阻碍了其蛋白质组分析，尤其是对于定量LC-MS/MS方法。为了克服这一局限性，开发了一种方法，包括使用液氮在低渗试剂中进行一个细胞破碎步骤，使用低速离心进行一个分离步骤，以及使用高速离心进行三个清洗步骤。颗粒含有血浆、核和线粒体膜，包括其整体、外周和锚定膜蛋白。通过四个单独实验的蛋白质分析验证了该方法的再现性，CV为7.7%，并通过两个实验之间的单个蛋白质的比较LC-MS/MS无标签定量验证了该法的重现性，99%的定量蛋白质的CV≤30%。细胞质、细胞核、线粒体及其膜的标记物的Western blot和LC-MS/MS结果表明，由于缺少或存在微量的非膜标记蛋白，富集的膜部分纯度很高。膜蛋白的平均产量为237μg/1000万HT29-MTX细胞。对膜富集样品进行LC-MS/MS分析，鉴定出2597个蛋白质组。总之，所开发的方法是可重复的，产生高纯度的膜组分，并产生高产量的膜蛋白。

PubMed免责声明

数字

图1
样品H清洗6次的典型工作流程示例。该程序包括一个细胞破碎步骤和六个清洗步骤，生成样品H1-7和膜组分样品H₂将O添加到1000万个细胞中，用移液管上下移动样品10次，在冰上培养10分钟，用液体N冷冻1分钟₂，室温解冻，10000×离心10 min克，4摄氏度。清除上清液。在清洗步骤中，在500μL H后₂将O添加到颗粒中，用移液管上下移取样品20次，在冰上培养10分钟，以100000×克，4摄氏度。经过多次洗涤步骤后，将500μL 8 M尿素和10 mM DTT添加到最终颗粒中。

图2
使用干冰/乙醇浴与液体N评估冻融效率₂比较表明，干冰/乙醇浴产生的膜蛋白与总蛋白的比率远高于液体N₂（23.4%对13.9%）。这与Western blot结果一致，因为未破裂的细胞污染了膜部分。E1，细胞分裂步骤上清液；E2，第一次清洗的上清液；E3，第二清洗步骤的上清液；E4，第三清洗步骤的上清液；E、膜蛋白组分颗粒。

图3
使用Western印迹法比较多个洗涤步骤。在比较中，分析了8个样品，生成了36个子样品，如补充表1所示。样品B仅包括一个膜隔离步骤；样品C-G分别包括一个膜分离步骤和1-5个清洗步骤。β-actin、LSD1和细胞色素c分别是细胞质、细胞核和线粒体的标记物。纳⁺/K（K）⁺-ATP酶、Lamin B1和COX IV分别是血浆、核和线粒体膜的标记物。在没有清洗步骤的情况下（样品B和B1），膜蛋白组分中富含β-肌动蛋白、LSD1和细胞色素c，表明非膜蛋白污染了膜组分。随着额外的洗涤步骤，它们的丰度降低。经过三个清洗步骤后，膜组分（样品E）中β-肌动蛋白和LSD1的丰度很低，而细胞色素c在膜组分中无法检测到。因此，膜富集法选择了三个洗涤步骤。

图4
方法的再现性。在不同的日子进行，1000万HT29-MTX细胞的总蛋白测量值为1687.1、1780.1、1583.9和1939.1μg，膜蛋白组分为13.3、14.4、12.0和13.9%。总蛋白和膜蛋白产率的变异系数分别为8.6%和7.7%，表明膜富集法具有较高的重复性。E1，细胞分裂步骤上清液；E2，第一次清洗的上清液；E3，第二清洗步骤的上清液；E4，第三清洗步骤的上清液；E、膜蛋白组分颗粒。

图5
定量LC-MS/MS分析。（A）在2362个蛋白质中，2001个蛋白质（85%）的CV≤15%，200个蛋白质（8%）的CV>15%和≤20%，91个蛋白质（4%）的CV<20%和≤35%，41个蛋白质（2%）的CV>25%和≤30%，只有29个蛋白质（1%）的CV大于30%。单个蛋白质CV分析清楚显示99%的蛋白质用可接受的CV进行了量化，验证了富集方法的再现性。（B）给出了六种标记蛋白的强度和变异系数。膜蛋白标记物Na⁺/K（K）⁺-ATP酶（ATP1A1）、拉明B1（LMNB1）和COX IV（COX4I1）的变异系数分别为6%、7%和13%。膜蛋白富集样品中未检测到非膜蛋白标记物β-肌动蛋白（ACTB）和LSD1。线粒体标记蛋白细胞色素c（CYCS）的检测和定量CV为4%，但其强度仅为线粒体膜蛋白标记物COX IV（COX4I1）的15%。图5B中的数据也与图3中的纯度分析数据一致，表明膜部分是高纯度的。

请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

癌细胞质膜蛋白的高效分离和定量蛋白质组学分析，用于识别转移相关的细胞表面标记物。
Lund R，Leth Larsen R，Jensen ON，Ditzel HJ。 Lund R等人。蛋白质组研究杂志，2009年6月；8(6):3078-90. doi:10.1021/pr801091k。蛋白质组研究杂志，2009年。 PMID：19341246
离线高pH反相分馏和纳米液相色谱-质谱法用于细胞系的整体蛋白质组分析。
王浩、孙旭、张毅、陈旭、刘鹏、刘斌。王浩等。色谱B分析技术生物生命科学杂志。2015年1月1日；974:90-5. doi:10.1016/j.jchromb.2014.10.031。Epub 2014年11月4日。色谱B分析技术生物生命科学杂志。2015 PMID：25463202
蛋白质组分析用人类血小板膜的富集。
Greening DW、Glenister KM、Sparrow RL、Simpson RJ。 Greening DW等人。方法分子生物学。2009;528:245-58. doi:10.1007/978-1-60327-310-7_17。方法分子生物学。2009 PMID：19153697
直接的蛋白质组分析揭示了细胞中蛋白质的真实动态。
Ichibangase T，Imai K。 Ichibangase T等人。《药物生物识别分析杂志》。2014年12月；101:31-9. doi:10.1016/j.jpba/2014.05.036。Epub 2014年6月2日。《药物生物识别分析杂志》。2014 PMID：24953415 审查。
串联质谱法鸟枪鉴定完整膜蛋白的策略。
Lu B、McClatchy DB、Kim JY、Yates JR第三。 Lu B等。蛋白质组学。2008年10月；8(19):3947-55. doi:10.1002/pmic.200800120。蛋白质组学。2008 PMID：18780349 审查。

查看所有类似文章

引用人

使用TurboID和TurboID-Start生物素连接酶的简化生物素化、富集和分析增强的质膜蛋白鉴定。
Sarihan M、Kasap M、Akpinar G。 Sarihan M等人。《分子生物学杂志》。2024年4月；257（1-2）：91-105。doi:10.1007/s00232-023-00303-y。电子出版2024年1月30日。《分子生物学杂志》。2024 PMID：38289568
CDK相关激酶的泛素蛋白水解调节真菌病原新生隐球菌中的泰坦细胞形成和毒力。
曹C，王K，王Y，刘TB，里维拉A，薛C。曹C等。国家公社。2022年10月27日；13(1):6397. doi:10.1038/s41467-022-34151-6。国家公社。2022 PMID：36302775 免费PMC文章。
蛋白质组学结合体外模型研究肝吸虫新孵出幼体与宿主肠道细胞之间的早期串扰。
Becerro-Recio D、Serrat J、López-García M、Sotillo J、Simón F、González-Miguel J、Siles-Lucas M。 Becerro-Recio D等人。 PLoS忽略奖杯。2022年10月12日；16（10）：e0010811。doi:10.1371/journal.pntd.0010811。eCollection 2022年10月。公共科学图书馆（PLoS）负面特罗普疾病。2022 PMID：36223411 免费PMC文章。
采用一种高效的自然杀伤细胞膜蛋白提取方法鉴定瞬时受体电位的美拉司他丁3蛋白型肽。
马加瓦CT、Eaton-Fitch N、Balinas C、Sasso EM、Thapaliya K、Barnden L、Maksoud R、Weigel B、Rudd PA、Herrero LJ、Marshall Gradisnik S。 Magawa CT等人。前生理学。2022年9月23日；13:947723. doi:10.3389/fphys.2022.947723。eCollection 2022年。前生理学。2022 PMID：36213251 免费PMC文章。
串联质谱（MS/MS）在生物医学研究蛋白质分析中的应用。
Neagu AN、Jayathirtha M、Baxter E、Donnelly M、Petre BA、Darie CC。 Neagu AN等人。分子。2022年4月8日；27(8):2411. doi:10.3390/分子27082411。分子。2022 PMID：35458608 免费PMC文章。审查。

查看所有“被引用”文章

工具书类

1. Tan S，Tan HT，Chung MC。蛋白质组学。2008;8:3924–3932.-公共医学
1. Dormeyer W、van Hoof D、Mummery CL、Krijgsveld J、Heck AJ。蛋白质组学。2008;8:4036–4053.-公共医学
1. Helbig AO、Heck AJ、Slijper M.J.蛋白质组学。2010;73:868–878.-公共医学
1. Groen AJ，Lilley KS。蛋白质组学专家评论。2010;7:867–878.-公共医学
1. Rucevic M，Hixson D，Josic D.电泳。2011;32:1549–1564.-公共医学

出版物类型

行动

MeSH术语

行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动

物质

行动
行动

赠款和资金

LinkOut-更多资源

全文源
其他文献来源
- 镜片-专利引文
- scite智能引文

[1] Tan S，Tan HT，Chung MC。蛋白质组学。2008;8:3924–3932.-公共医学

[2] Tan S，Tan HT，Chung MC。蛋白质组学。2008;8:3924–3932.-公共医学

[3] Dormeyer W、van Hoof D、Mummery CL、Krijgsveld J、Heck AJ。蛋白质组学。2008;8:4036–4053.-公共医学

[4] Dormeyer W、van Hoof D、Mummery CL、Krijgsveld J、Heck AJ。蛋白质组学。2008;8:4036–4053.-公共医学

[5] Helbig AO、Heck AJ、Slijper M.J.蛋白质组学。2010;73:868–878.-公共医学

[6] Helbig AO、Heck AJ、Slijper M.J.蛋白质组学。2010;73:868–878.-公共医学

[7] Groen AJ，Lilley KS。蛋白质组学专家评论。2010;7:867–878.-公共医学

[8] Groen AJ，Lilley KS。蛋白质组学专家评论。2010;7:867–878.-公共医学

[9] Rucevic M，Hixson D，Josic D.电泳。2011;32:1549–1564.-公共医学

[10] Rucevic M，Hixson D，Josic D.电泳。2011;32:1549–1564.-公共医学

将引文保存到文件

电子邮件引文

添加到集合

添加到我的书目

您保存的搜索

为外部引文管理软件创建文件

您的RSS源

用于定量膜蛋白质组学的LC-MS/MS方法中高纯度和高收率富集膜蛋白的可重复方法

附属

用于定量膜蛋白质组学的LC-MS/MS方法中高纯度和高收率富集膜蛋白的可重复方法

作者

附属

摘要

数字

类似文章

引用人

工具书类

出版物类型

MeSH术语

物质

赠款和资金

LinkOut-更多资源

全文源

其他文献来源

摘要

数字

类似文章

引用人

工具书类

出版物类型

MeSH术语

物质

相关信息

赠款和资金

LinkOut-更多资源

全文源

其他文献来源