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.2013年2月15日；126（第4部分）：999-1008。
doi:10.1242/jcs.119701。 Epub 2012年12月21日。

RARγ对维甲酸诱导的胚胎干细胞染色质重塑和转录激活至关重要

瓦森德拉·卡西亚普 1, 克里斯蒂安·劳尔森, 法比恩·布伦特, Agnes J小瓶, 约瑟夫·M·斯堪的纳维亚, 洛林·J·古达斯
附属公司

RARγ对维甲酸诱导的胚胎干细胞染色质重塑和转录激活至关重要

瓦松德拉·卡什亚普等。 细胞科学杂志. .

摘要

我们利用视黄酸受体γ（γ）敲除（RARγ（-/-））胚胎干细胞作为模型系统来分析RARγ介导的干细胞分化的转录调控。ES细胞中由全反式维甲酸（RA）调节的大多数转录物依赖于功能性RARγ信号。值得注意的是，这些RA-RARγ靶基因中的许多与类视黄醇的摄取和代谢有关。例如，Lrat（卵磷脂：视黄醇酰基转移酶）、Stra6（由视黄酸6刺激）、Crabp2（细胞视黄酸结合蛋白2）和Cyp26a1（细胞色素p450 26a1）转录物在野生型（WT）中诱导，但在RARγ（-/-）细胞中不诱导。RA治疗WT后，转录因子Pbx1（前B细胞白血病同源盒-1）、Wt1（Wilm肿瘤基因-1）和Meis1（髓系嗜生态病毒整合位点-1）的转录物增加，但RARγ（-/-）细胞的转录物没有增加。相反，即使在缺乏RARγ的情况下，RA也会诱导Stra8、Dleu7、Leftb、Pitx2和Cdx1 mRNA。Meis1表观遗传标记的定位显示，RA在WT的近端启动子和转录起始位点下游的两个位点诱导H3K9/K14ac表观遗传标志快速增加，但在RARγ（-/-）细胞中没有。因此，与RA相关的H3K9/K14ac表观遗传标记的增加需要RARγ，并且与Meis1转录水平的增加相关，而即使在没有RARγ的情况下，Meis1近端启动子中也存在H3K4me3。相反，在Lrat近端启动子主要是H3K4me3标记，而不是H3K9/K14ac标记，在RA反应中增加，与RARγ的存在无关。我们的数据显示了与ES细胞中添加RARγ激动剂RA相关的主要表观遗传学变化。

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数字

图1。
图1。
WT和RARγ转录水平的微阵列分析−/−ES细胞。(A类)RA治疗24天后转录水平升高的基因 h.白色圆圈显示RA在WT ES细胞中诱导的基因；灰色圆圈显示RA在RARγ阴性ES细胞中诱导的基因。RARγ−/−如前所述生成ES细胞（Kashyap等人，2011年）。微阵列数据是从单细胞克隆的ES细胞系中产生的。(B类)未经治疗（仅限车辆）WT和RARγ之间差异表达的基因−/−24时的单元格 h.白色圆圈显示未处理WT中的基因表达水平高于RARγ−/−细胞。灰色圆圈显示未经处理的RARγ中基因表达水平较高−/−与WT相比(C类)RA治疗24天后转录水平下降的基因 h.白色圆圈显示WT细胞中RA抑制的基因。灰色圆圈显示RARγ中RA抑制的基因−/−细胞。通过实时RT-PCR验证的基因以粗体显示。请注意，维恩图仅描述了每组中确定的基因的子集（有关完整列表，请参阅补充材料表S2–S7)。(D类)WT和RARγ转录水平验证−/−通过终点PCR检测ES细胞。Meis1、Lrat、Hoxa1、Stra6和Pknox2显示RARγ中RA依赖性诱导减少−/−细胞相对于WT，而Stra8和Cdx1是在缺乏RARγ的情况下诱导的。DNMT3L、Suv39h1和Tex13在WT和RARγ之间差异表达−/−ES细胞与RA无关。在D中进行了多次实验，结果相同；显示了具有代表性的样本。
图2。
图2。
RA调节维甲酸代谢基因的诱导。(A–E)WT和RARγ中Lrat、Stra6、Cyp26a1、Crabp2和36B4（对照）的转录水平−/−ES细胞。实验使用独立的RNA样本进行了三次(▪ 重量；△ RARγ−/−); 误差条表示平均值的标准误差（标准误差）。(F类)Lrat基因组区域的ChIP-ChIP热图显示WT和RARγ中的H3K9/14ac、H3K27me3和H3K4me3组蛋白标记−/−增加RA暴露次数（0、1、8和24 h、 黑色三角形）。颜色表示日志2-ChIP-ChIP数据集中转化的ChIP富集（复制方法）。列显示基因组位点，行显示IP状态。统计显著性：*P（P）<0.05, **P（P）<0.01***P（P）<0.005. 日志的色标2富集显示在ChIP-ChIP数据面板下方。Lrat基因组位置（蓝色调）如下图所示。
图3。
图3。
RA调节转录因子的诱导。(A–E)WT和RARγ的转录水平−/−Meis1、Pbx1、Wt1、Gbx2和Barx1的ES细胞。使用独立的RNA样本（填充正方形、WT、开放三角形、RARγ）进行三次实验−/−); 误差线表示标准误差(F类)Meis1近端启动子区的ChIP-ChIP热图显示WT和RARγ中的H3K9/14ac、H3K27me3和H3K4me3组蛋白标记−/−增加RA暴露次数（0、1、8和24 h、 黑色三角形）。颜色表示日志2-ChIP-ChIP数据集中转化的ChIP富集（复制方法）。DS1和DS2表示下游站点1和2；PP表示近端启动子区域。列显示基因组位点，行显示IP状态。统计显著性：P（P）<0.05, **P（P）<0.01***P（P）<0.005. 日志的色阶2富集显示在ChIP-ChIP数据面板下方。Meis1外显子（宽）和内含子（窄）的位置（蓝色调）以示意图的形式显示在底部。
图4。
图4。
H3K9/14ac、Suz12和H3K4me3与特定的Meis1元素相关。Meis1 P的ChIP分析参考序列WT和RARγ中的（pp）和Meis1下游元素（DS1和DS2）−/−ES细胞评估(A类)H3K9/14ac；(B类)Suz12；和(C类)H3K4me3与三个Meis1元素中的每一个相关。(D类)使用IgG作为阴性对照。每个实验至少重复三次，从新鲜的细胞开始，并通过定量PCR进行评估。数据被绘制为相对于IgG背景的倍数富集。请注意，每个面板中的y轴不同。数值为三个独立实验的平均值±标准偏差。统计显著性：*P（P）<0.05; 不另作说明，不重要。未经处理的灰色条；RA治疗24天 h、 黑色条。
图5。
图5。
RARγ、RXRα、H3K27ac、p300和PolII-CTD与特定Meis1元素的关联。Meis1 P的ChIP分析参考序列WT和RARγ中的（pp）和Meis1下游元素（DS1和DS2）−/−ES细胞评估(A类)RARγ(B类)RXRα(C类)H3K27ac(D类)第300页，以及(E类)具有三个Meis1元素中每一个的PolII CTD。(F类)IgG用作阴性对照。每个实验至少重复三次，从新鲜的细胞开始，并通过一式三份的定量PCR进行评估。数据绘制为IgG背景上的褶皱富集。数值为三个独立实验的平均值±标准偏差。统计显著性：*P（P）<0.05; 不另作说明，不重要。未经处理的灰色条；RA治疗24天 h、 黑色条。
图6。
图6。
RARγ敲除降低Meis1转录水平，异位RARγ2在RARγ中−/−细胞恢复Meis1转录水平。(A类)在WT ES细胞中，稳定shRNA敲除RARγ后，24和48天内源性Meis1转录水平分别下降到21%和45% 实时RT-PCR评估RA治疗h。相对靶向荧光素酶（shLuc）的对照shRNA，通过表达RARγ特异性shRNA（shRARγ），RARγ转录水平降低至25%。统计显著性：*P（P）<0.05, **P（P）<0.01***P（P）在类似条件下，相对于WT电池<0.005。(B类)在RARγ中−/−ES细胞RARγ的异位表达2恢复了Meis1转录物的RA反应水平。结果显示来自两个独立克隆（1和2）。统计显著性表示为*P（P）<0.05, **P（P）<0.01***P（P）<0.005（相对于未处理的细胞）。
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