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。2013年2月；125(2):273-88.
doi:10.1007/s00401-012-1043-z。 Epub 2012年9月9日。

人类野生型FUS的过度表达以年龄和剂量依赖的方式导致进行性运动神经元变性

杰奎琳·米切尔 1, 菲利普·麦戈德里克, 卡罗琳·万斯, 蒂博尔·霍尔托巴吉, 杰米恩·斯里德哈兰, 鲍里斯·罗杰尔, 伊丽莎白·L·都铎, 布拉德利·N·史密斯, 克里斯蒂安·克拉森, 克里斯托弗·C·J·米勒, 乔纳森·德库珀, 琳达·格林史密斯, 克里斯托弗·E·肖
附属机构

人类野生型FUS的过度表达以年龄和剂量依赖的方式导致进行性运动神经元变性

杰奎琳·米切尔等。 神经病理学学报。 2013年2月。

摘要

肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶变性（FTLD）是具有重叠临床、遗传和病理特征的持续进行性神经退行性疾病。融合型肉瘤（FUS）的细胞质内含物是FUS基因突变的几种FTLD和ALS患者的特征。FUS是一种多功能、主要是核、DNA和RNA结合蛋白。在这里，我们报告了过度表达野生型人类FUS的转基因小鼠发展出攻击性表型，在纯合子动物中出现早期震颤，继而后肢进行性瘫痪和12周死亡。脊髓中的大运动神经元丢失，伴有失神经和局部肌肉萎缩的神经生理学证据。脊髓中幸存的运动神经元大大增加了FUS的细胞质表达，球状和骨架状FUS阳性和泛素阴性内含物与星形胶质细胞和小胶质细胞反应性相关。在转基因小鼠的大脑中也检测到细胞质FUS内含物，没有明显的神经元丢失和少量星形胶质细胞或小胶质细胞激活。半合子FUS过表达小鼠没有表现出运动表型或病理学的证据。这些发现概括了人类ALS和FTLD患者的几种病理特征，并表明脆弱神经元中野生型FUS的过度表达可能是疾病的根源之一。此外，这些小鼠将提供一种新的模型来研究疾病机制和测试治疗方法。

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数字

图1
图1
小鼠hFUS过度表达会剂量依赖性地降低内源性Fus表达。一使用抗FUS抗体对NTg和hFUS（+/-）和（+/+）小鼠的脑裂解物进行Western blotting，结果显示由于HA标签的存在和较大的蛋白质尺寸，分子量略有增加，转基因动物中HA-hFUS和总FUS表达呈剂量依赖性增加(b条)伴随内源性Fus表达的降低(c（c）)（平均值±SEM；* 第页 < 0.05).d日用抗-HA抗体对组织裂解物进行Western blot检测，结果显示脑、脊髓和睾丸中的含量最高，而骨骼肌中的含量较低(Gastroc公司腓肠肌）、心脏和其他组织。(e（电子）–j个)抗HA抗体免疫组化显示hFUS蛋白在整个脊髓中表达(e（电子）–克)在大脑皮层(小时–j个;比例尺100μm）在两个hFUS中（+/-）(（f）,我)和（+/+）(克,j个)小鼠，这在NTg动物中是不存在的(e（电子）,小时)
图2
图2
hFUS在小鼠中的过度表达导致运动功能障碍和过早死亡。一hFUS（+/+）(实心三角形)小鼠在4周龄时体重没有增加，明显轻于NTg(实心圆)和hFUS（+/-）(实心矩形)来自5周龄小鼠的同窝鼠。此外，他们的体重比11周龄时的最大体重明显减轻。b条hFUS（+/+）小鼠从4周龄开始在旋转木马上表现出明显的损伤和快速下降。c（c）与与NTg和hFUS（+/-）同窝的小鼠相比，8周龄hFUS小鼠的运动活动显著减少。所有显示的数据均为平均值±SEM；* 第页 < 0.05.d日存活曲线显示hFUS（+/+）小鼠的平均存活时间为82±12天，而hFUS的存活时间与NTg小鼠没有显著差异。e（电子）8周龄hFUS（+/+）小鼠的典型示例(正确的动物)与NTg室友相比(左侧动物).（f）8周龄hFUS（+/+）小鼠的异常后肢张开
图3
图3
hFUS动物运动或认知功能相关脑区的FUS染色。HA-hFUS的过度表达导致体感FUS染色的剂量依赖性增加(一–c（c）)和岛屿(e（电子）–克)皮质，新纹状体(我–k个)小脑浦肯野细胞(米–o个)和海马CA3区的一部分(q个-秒) (比例尺50微米）。纯合子动物的高倍图像显示躯体感觉中骨骼样和弥散细胞质染色(d日)和岛屿(小时)皮质，新纹状体(我)和小脑的浦肯野细胞(第页)在海马体中的程度要小得多(t吨) (比例尺20微米）
图4
图4
hFUS过度表达导致纯合子动物细胞质定位的显著改变。(一–c（c）)FUS在运动皮层的表达在两组中均增加（+/-）(b条)和（+/+）(c（c）)hFUS小鼠与NTg小鼠的比较(一)室友(比例尺50微米）。d日hFUS（+/-）切片的高倍图像主要显示核和核周FUS染色(比例尺20微米）。e（电子）hFUS（+/+）切片的高倍图像显示许多神经元胞质染色(黑色箭头)这在hFUS（+/-）和NTg小鼠中都不存在。此外，在两种hFUS（+/+）的许多细胞中都可见环状核周FUS染色(红色箭头)，以及在较小程度上hFUS（+/-）动物(比例尺20微米）。（f）第二张高倍图像显示了hHUS（+/+）大脑皮层神经元的细胞质染色，即使没有异常的环状堆积物。克大脑核和细胞溶质部分的蛋白质印迹显示细胞溶质和核FUS水平均增加。GAPDH用作细胞溶质部分的标记物，Lamin B1用作核部分。小时细胞溶质FUS水平的量化，显示仅hFUS（+/+）动物的FUS水平增加(* 第页 < 0.05).我核FUS水平的量化，显示转基因小鼠FUS的表达依赖性增加(* 第页<0.05）。j个一幅典型的共焦图像，显示hFUS（+/+）皮层神经元中观察到的内含物的环状性质(比例尺20微米）
图5
图5
FUS染色不与皮质中的泛素共定位。一–c（c）hFUS运动皮层泛素阳性神经元增多（+/+）(c（c）)在较小程度上（+/-）(b条)与NTg对照组相比的动物(一) (比例尺50μm），以及d日hFUS（+/+）小鼠普遍存在弱泛素染色(比例尺20微米）。e（电子）荧光标记hFUS（+/+）小鼠运动皮层中的HA标记的FUS和泛素，显示出被泛素包围的细胞质FUS沉积物，以及弥漫颗粒细胞质FUS染色，伴随着小的泛素阳性细胞质颗粒，但没有两种蛋白的共标记(比例尺5微米）
图6
图6
hFUS小鼠的FUS和泛素脊髓病理学。一–c（c）FUS在脊髓前角的表达在两组中均增加（+/-）(b条)和（+/+）(c（c）)hFUS小鼠与NTg同窝小鼠的比较(一) (比例尺50微米）。d日显示FUS夹杂物的高倍图像(箭头)在hFUS（+/+）动物的大神经元中。(比例尺20微米）。没有证据表明hFUS（+/-）或NTg动物体内存在内含物。e（电子）–克异常颗粒泛素仅存在于hFUS（+/+）的少数大神经元中(克)动物，在任一NTg的脊髓前角均无明显染色(e（电子）)或hFUS（+/-）(（f）)动物(比例尺50微米）。小时高倍图像显示两个大神经元内弥漫的颗粒状泛素染色，未见明显的大包涵体(比例尺20微米）。我hFUS（+/+）小鼠脊髓前角神经元中HA标记的FUS和泛素的荧光标记显示，细胞细胞质中有多个小FUS内含物，细胞质中弥漫低水平泛素染色，但没有证据表明HA-FUS和泛碱共定位(比例尺5微米）
图7
图7
hFUS过度表达导致纯合子动物运动神经元的丢失。一–c（c）NTg腰腹角运动神经元的甲酚紫染色(一)，hFUS（+/-）(b条)和hFUS（+/+）(c（c）)小鼠，显示只有hFUS（+/+）动物中的神经元缺乏(比例尺100微米）。d日与非转基因对照组相比，hFUS（+/+）小鼠腰椎前角运动神经元的细胞计数显示约60%的运动神经元显著丢失。相比之下，hFUS（+/-）小鼠运动神经元数量没有显著差异(* 第页 < 0.05)
图8
图8
hFUS小鼠脊髓神经炎症增加，伴有肌肉萎缩。一–c（c）在（+/-）和（+/+）hFUS小鼠的脊髓前角中，使用GFAP免疫组织化学检测到星形胶质细胞增生症中FUS的表达显著增加，且呈依赖性(比例尺20微米）。d日–我用CD68免疫组织化学检测到，FUS表达依赖于小胶质细胞激活的增加，在脊髓前角有轻微程度的明显增加(d日–（f）)更引人注目的是背柱(克,小时)hFUS（+/+）小鼠。hFUS（+/-）动物中也存在极少数细胞(箭头) (比例尺20微米）。j个–我脊髓的血红素和曙红染色显示，终末期hFUS（+/+）小鼠存活的运动神经元中没有嗜酸性内含物。米–o个肌肉showin的苏木精和伊红染色克hFUS（+/+）小鼠运动神经元变性的特征是散在和成组的肌纤维萎缩，并有证据表明hFUS动物的肌纤维紊乱(比例尺20微米）
图9
图9
hFUS小鼠的神经肌肉功能。一,b条后肢TA产生的破伤风力(一)和EDL(b条)与NTg小鼠相比，hFUS（+/+）小鼠的肌肉显著减少，TA和EDL的肌力缺陷分别约为80%和20%。c（c）,d日与NTg和hFUS动物相比，hFUS（+/+）小鼠的两块肌肉松弛速度显著减慢。e（电子）,（f）从所有组的EDL中记录电机单元编号。NTg和hFUS（+/+）小鼠运动单位轨迹的典型示例如所示(e（电子）)，平均运动单位存活率的结果总结在条形图(（f）)hFUS（+/+）小鼠的运动单位减少了20%。克NTg和hFUS（+/+）小鼠的特征性疲劳痕迹，由快速EDL肌肉在180秒以上的强直刺激产生。每个强直收缩都由一个单线在轨迹中，直线的长度与产生的力有关。力迹线的长度F类 180码（时间=180 s）与F类 t0（吨）给出了疲劳指数（FI）。与痕迹开始时相比，野生型小鼠在刺激期结束时失去了很大比例的力量，因此FI较低。相比之下，hFUS（+/+）小鼠的EDL不易疲劳，FI较高每条轨迹的右侧是从经SDH染色的NTg和hFUS（+/+）小鼠获得的TA肌肉横截面。NTg动物表现出一种混合的深染氧化型I纤维和浅染氧化不快型II纤维。相反，hFUS（+/+）小鼠主要表现为深色染色，表明肌肉纤维转化为较慢的表型。小时NTg和hFUS（+/-）和（+/+）小鼠EDL肌肉中FI的总结。
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