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.2012年10月12日；287(42):35382-35396.
doi:10.1074/jbc。M112.409797。 Epub 2012年8月22日。

半胱天冬酶裂解GAB1衔接蛋白在肝细胞生长因子/分散因子-MET受体蛋白信号转导中的抗凋亡作用

阿尔诺·勒戈夫 1, 宗陵记 2, 贝瑞妮斯·勒克莱尔 1, 罗兰·波雷特 1, 亚历山大·穆格尔 1, Cateline Guerardel公司 1, Yvan de Launoit公司 1, 杰罗姆·维科尼 1, 戈蒂尔·古尔马希提格 1, Véronique Fafeur公司 三
附属机构

半胱天冬酶裂解GAB1衔接蛋白在肝细胞生长因子/分散因子-MET受体蛋白信号转导中的抗凋亡作用

阿尔诺·勒戈夫等。 生物化学杂志. .

摘要

GRB2相关结合物1（GAB1）对接/支架蛋白是肝细胞生长因子/分散因子（HGF/SF）激活的MET-酪氨酸激酶受体的关键介体。激活的MET促进GAB1的招募和酪氨酸磷酸化，GAB1反过来招募多个蛋白质并介导MET信号，导致细胞存活、运动和形态发生。我们之前报道过，在没有配体的情况下，MET是凋亡过程中的一个功能性caspase靶点，允许生成p40-MET片段来放大凋亡。在本研究中，我们通过证明含有MET结合域的半胱氨酸天冬氨酸水解酶缺失的p35-GAB1片段，确定GAB1也是一个功能性半胱氨酸水解酶靶点。GAB1在MET之前被半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶裂解，生成的p35-GAB1片段在HGF/SF结合时被MET磷酸化，可以与GAB1伙伴的子集、PI3K和GRB2相互作用，但不能与SHP2相互作用。该p35-GAB1片段通过维持HGF/SF诱导的MET激活AKT和阻碍p40-MET促凋亡功能，促进细胞存活。这些数据证明了半胱氨酸天冬氨酸酶裂解的GAB1在HGF/SF-MET信号传导中的抗凋亡作用。

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数字

图1。
图1。
应激条件或siGAB1敲除导致GAB1表达下调，有助于抑制HGF/SF-MET下游信号传导。 一MDCK细胞在0%FBS培养基中培养8小时，不含（−）或存在（+）不同的凋亡诱导物：茴香霉素(阿尼，50μ米)，TNFα（30 ng/ml）和环己酰亚胺的组合(瑞士法郎，10μg/ml），放线菌素D(实际D，5μg/ml）或staurosporine(STS公司, 1 μ米). 对于紫外线处理，细胞暴露在400 J/m的UV-B光下2培养2.5分钟，然后在0%FBS培养基中再培养8小时。对全细胞裂解物进行免疫印迹(IB公司)使用抗C末端GAB1抗体(GAB1 C类)抗活性caspase-3抗体。使用抗ERK2抗体对过滤器进行剥离和重制，以验证可比负载。GAB1被检测为一对倍体，可能对应于已知的GAB1的a和B亚型，由选择性剪接产生。b不使用（−）或（+）茴香霉素处理MDCK、MCF10A、U2OS、HepG2或HeLa细胞8 h(阿尼, 50 μ米)在0%FBS培养基中。使用抗体对全细胞裂解物进行免疫印迹，如下所述面板交流，上部面板，用茴香霉素处理MDCK细胞(阿尼)或按照上述规定在指定的时间（小时）内不治疗。收集细胞裂解物，然后使用与所述相同的抗体进行免疫印迹分析面板a(IB法案。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3).下部面板，台盼蓝染色法测定细胞存活率。d日，HeLa细胞瞬时转染siRNA阴性对照（−）或靶向内源性Gab1转录物的siRNA(siGab1型, +). 第二天，将细胞在0.1%FBS培养基中培养6 h，然后用HGF（50 ng/ml，10 min）、NGF（100 ng/ml，10 min米然后使用针对GAB1的Tyr-472周围残基的抗GAB1中间抗体（GAB1 M）对细胞裂解物进行免疫印迹分析。相同的印迹被剥离，并使用所示抗体重复多次。e（电子），HeLa细胞瞬时转染siRNA阴性对照(siCtrl键)或靶向内源性GAB1转录物的siRNA(siGAB1基因). 第二天，在0.1%FBS培养基中培养细胞过夜，然后用TRAIL（30 ng/ml）和蛋白酶体抑制剂ALLN（50μ米)或不经处理（−）4小时。然后用HGF/SF（50 ng/ml）处理（+）或不处理（−）细胞10分钟。用针对GAB1-MBD的抗体对细胞裂解物进行免疫印迹分析(IB GAB1-MBD公司)). 相同的印迹被剥离，并使用所示抗体重复多次。PARP裂解检测(氯。)用于监测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的激活。
图2。
图2。
应激条件导致GAB1稳定片段的产生，HGF/SF阻碍了这种半胱氨酸蛋白酶依赖机制。 一，用staurosporine处理MDCK细胞(STS公司, 1 μ米)或未经处理（−）8小时，然后溶解。免疫印迹分析(IB公司)在细胞裂解物上进行，并使用抗GAB1 MBD或抗MET抗体探测膜。将过滤器剥离，并用抗PARP抗体和抗ERK2抗体重新过滤。bMDCK细胞在0%FBS培养基中培养，并在不使用（−）或使用通用caspase抑制剂Z-VAD-FMK（20μ米)30分钟，然后用茴香霉素治疗(阿尼, 50 μ米)，TNFα（30 ng/ml）和环己酰亚胺的组合(瑞士法郎，10μg/ml）或staurosporine(STS公司, 2 μ米)持续16小时。使用指示的抗体通过免疫印迹分析细胞裂解物。c（c）对MDCK细胞进行裂解，在没有（−）或存在通用caspase抑制剂Z-VAD-FMK（40μ米). 然后使用抗GAB1 MBD或抗MET抗体对样品进行免疫印迹分析。使用抗ERK2抗体对过滤器进行剥离和重制，以验证可比负载。d日用HGF/SF预处理MDCK细胞(HGF/SF预处理。，10 ng/ml）或未经处理（−）1 h，并在添加或不添加（−）茴香霉素的情况下再培养10 h(阿尼, 50 μ米). 使用所示抗体通过免疫印迹分析细胞裂解物。a-c公司，箭头指向全长(黑色箭头)并裂开(黑色箭头)蛋白质。这个白色小箭头对应于非特异性免疫反应带(NS公司). 裂解蛋白质缩写为氯.
图3。
图3。
p35-GAB1片段被四个半胱氨酸蛋白酶裂解位点包围，并包含MET结合域。 一，使用Myc-tagged野生型瞬时转染24小时后(重量)GAB1或其突变型D370N、D281N/D370N或D212-281-370N，HeLa细胞在0.1%FBS培养基中培养过夜。然后用TRAIL（30 ng/ml）和蛋白酶体抑制剂ALLN（50μg/ml）联合处理（+）细胞米)或未经处理（−）5小时。对于每种情况，通过免疫印迹法分析相同数量的全细胞提取物(IB公司)使用抗GAB1 MBD或抗MET抗体。b，纯化的重组GST和GST-GAB1558–694蛋白质在37°C下与（+）或不与（−）重组活性caspase-3孵育1 h。然后用SDS-PAGE分离产物并用考马斯蓝染色(上部面板). GST-GAB1的示意图558–694结构也显示在下部面板。c（c），纯化重组GST-GAB1558–694之前在MALDI-TOF光谱仪上对蛋白质进行了分析(左侧面板)在低浓度（1:100稀释）下用caspase-3裂解后，中间面板)或高浓度（1:1稀释，右侧面板)在37°C下持续1h。显示了GST-GAB1和主要解理产物的实验测定质量。d日用Myc-tagged wild type（WT）GAB1或其突变体D610N转染MDCK细胞24 h。然后用茴香霉素处理细胞(阿尼, 50 μ米)或未经处理（−）8 h。收集细胞裂解物，并使用抗GAB1 MBD抗体进行免疫印迹分析。e（电子）用Myc-tagged wild type（WT）GAB1或其突变型D212N/D281N/D370N/D610N瞬时转染24 h后，HeLa细胞在0.1%FBS的培养基中培养过夜。然后，细胞未经处理（−）或用Z-VAD-FMK（20μ米)立即孵育30分钟，然后加（+）或不加（−）TRAIL和ALLN孵育5小时（如面板a). 然后使用抗GAB1-MBD抗体对全细胞裂解物进行免疫印迹分析。a–e，箭头指向全长(黑色箭头)并被劈开(黑色箭头)蛋白质。Cleaved GAB1缩写为第1类GAB1.
图4。
图4。
MET和GAB1都被应激或caspase 3降解和碎片化，GAB1适配器比MET受体的caspase释放更快、进行性更强。 一HeLa细胞未经处理（−）或用staurosporine处理(STS公司, 1 μ米)以小时为单位的指示时间。然后对细胞裂解物进行免疫印迹(IB公司)使用指示的抗体。b，MDCK细胞的裂解物在37°C下不含（−）或含活性纯化caspase-3培养指定时间（分钟）。然后使用所示抗体通过免疫印迹法对样品进行分析。一和b，箭头指向全长(黑色箭头)并被劈开(黑色箭头)蛋白质。这个白色小箭头对应于非特异性免疫反应带(NS公司). 裂解蛋白质缩写为氯.
图5。
图5。
p35-GAB1片段的亚细胞定位和结合能力。 一稳定表达FLAG-p35-GAB1-GFP蛋白的MDCK细胞瞬时转染siRNA对照(siCtrl键)或靶向内源性GAB1转录物(siGAB1型). 第二天，细胞在0.1%FBS培养基中培养过夜，然后用HGF/SF（50 ng/ml）处理10分钟（+）或不处理（-）。细胞裂解物在亚细胞区室中依次分级(努，细胞核；毫巴，膜；塞浦路斯，胞浆）并进行免疫印迹(IB公司)使用GAB1或MET抗体以及针对经典间隔标记（Na）的抗体进行分析+/K（K）+-ATP酶、拉明B1和GAPDH）。b和c（c），MDCK细胞在无0.1%FBS的培养基中培养过夜(b)或存在(c（c）)茴香霉素(阿尼, 50 μ米)然后不处理（−）或用HGF/SF（100 ng/ml）处理（+）5分钟。制备细胞裂解物，并在没有（−(His-p35-GAB1)或全长GAB1(他的完整GAB1)蛋白质。进行下拉分析，并使用所示抗体通过免疫印迹分析洗脱液。下拉前细胞总溶解物(输入)也进行了加载和分析(补充图S4，b和c（c）). 在c（c），的白色箭头对应于非特异性免疫反应带(NS公司).
图6。
图6。
作为对HGF/SF的反应，p35-GAB1片段维持AKT活化和细胞迁移，并允许对凋亡应激的抵抗。 一稳定表达FLAG-GFP或FLAG-p35-GAB1-GFP蛋白的MDCK细胞瞬时转染siRNA阴性对照(siCT（信号电流互感器）)或以内源性GAB1转录物为靶点的siRNA(siGAB1型). 第二天，细胞在0.1%FBS培养基中培养过夜，然后用HGF/SF（50 ng/ml）处理10分钟（+）或不处理（-）。细胞裂解物进行免疫印迹(IB公司)使用所示抗体进行分析。注意内源性GAB1的表达(恩多格。GAB1类)与FLAG-p35-GAB1-GFP相比微弱。b，用siRNA阴性对照瞬时转染稳定表达FLAG-GFP或FLAG-p35-GAB1-GFP蛋白的MDCK细胞(siCtrl键)或以内源性GAB1转录物为靶点的siRNA(siGAB1型). 第二天进行了划痕伤口愈合试验。在不含（−）或含HGF/SF（30 ng/ml）的培养基（0.1%FBS）中培养24小时后，使用Hemacolor试剂盒对细胞进行染色，并在倒置显微镜（×40）下观察伤口闭合区域。虚线添加以描绘迁移细胞前沿。注意，在HGF/SF孵育之前，样本之间的划伤宽度是可比较的。c（c）如上文所述，用siRNA瞬时转染稳定表达FLAG-GFP或FLAG-p35-GAB1-GFP蛋白的MDCK细胞。第二天，用或不用茴香霉素处理细胞16小时(阿尼, 1 μ米)在无（−）或有（+）HGF/SF（30 ng/ml）的培养基中-0.1%FBS。采用MTT法评估细胞存活率。结果以未处理对照细胞的百分比表示。所有值均显示为三次独立MTT分析的平均值±S.D.，每种情况测量三次（**，第页<0.01使用学生的t吨Bonferroni校正测试）。
图7。
图7。
p35-GAB1片段阻碍p40-MET片段对caspase 3活性的扩增。稳定表达FLAG-GFP或FLAG-p35-GAB1-GFP蛋白的MDCK-p40-MET-Tet-On细胞被靶向内源性GAB1和MET转录物的siRNA瞬时转染(硅金属晶体管+siGAB1型). 在完全培养基中培养48小时后，将细胞在含有（+）或不含有（−）多西环素（0.2μg/ml）的0.1%FBS的培养基中饥饿过夜，随后用TNFα（30 ng/ml）和ALLN（50μg/ml）处理米)4小时（+）或不处理（−）。细胞裂解物进行免疫印迹分析(IB公司)使用指定的抗体(一)或通过独立实验进行caspase-3活性测定(b) (*,第页<0.05使用学生的t吨Bonferroni校正测试）。在不同的实验中也得到了类似的结果。
图8。
图8。
GAB1适配器是压力条件下HGF/SF-MET信号的检查点调节器。 一，显示了GAB1衔接子及其胱天蛋白酶裂解的p35-GAB1片段在不同应激条件下HGF/SF-MET信号传导中的调节作用的模型（见“讨论”）。完整MET或全GAB1分别代表全长MET或全长GAB1；p40-金属和第35-GAB1页分别代表MET和GAB1的caspase依赖片段；+++，对HGF/SF反应强烈；+，对HGF/SF的反应降低；−，没有回应。b图中所示为目前在GAB1适配器和主要信号伙伴结合位点中为全长GAB1蛋白或p35-GAB1片段确定的四个半胱氨酸蛋白酶裂解位点的示意图。GAB1中的特定aa特别对应于已知参与SH2域蛋白结合的磷酸化酪氨酸残基。指出了SDS凝胶中GAB1和p35-GAB1的表观分子量。c（c），序列比对表明GAB1-MBS和目前已鉴定的不同物种GAB1中caspase裂解位点保持不变。所有序列均从UniProt数据库中检索，并显示UniProt条目。编号是根据人类顺序指示的。天冬氨酸部位是下划线的。另请参阅中各种物种的完整序列比对补充图S5.
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引用人

  • 吉尔吉斯斯坦人群急性和慢性高原暴露期间的循环凋亡信号。
    Kosanovic D、Platzek SM、Petrovic A、Sydykov A、Maripov A、Mamazhakypov A、Sartmyrzaeva M、Muratali Uulu K、Cholponbaeva M、Toktosunova A、Omurzakov N、Duishobaev M、Vroom C、Pak O、Weissmann N、Ghofani HA、Sarybaev A、Schermuly RT。 Kosanovic D等人。 前生理学。2019年2月5日；10:54. doi:10.3389/fphys.2019.00054。2019年eCollection。 前生理学。2019 PMID：30804801 免费PMC文章。

工具书类

    1. Schlessinger J.（2000）受体酪氨酸激酶的细胞信号传导。手机103、211–225-公共医学
    1. Pawson T.、Scott J.D.（1997）通过支架、锚定和衔接蛋白进行信号传递。科学278，2075–2080-公共医学
    1. Buday L.，Tompa P.（2010）《支架蛋白和相关分子的功能分类》。二月二十七日，4348–4355-公共医学
    1. Holgado-Madruga M.、Emlet D.R.、Moscatello D.K.、Godwin A.K.、Wong A.J.（1996）EGF和胰岛素受体信号中的Grb2相关对接蛋白。自然379560-564-公共医学
    1. Weidner K.M.、Di Cesare S.、Sachs M.、Brinkmann V.、Behrens J.、Birchmeier W.（1996）Gab1和c-Met受体酪氨酸激酶之间的相互作用负责上皮形态发生。《自然》384173–176-公共医学

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