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.2012;7（7）：e40769。
doi:10.1371/journal.pone.0040769。 Epub 2012年7月16日。

PP1/NIPP1在引导人类癌细胞迁移中的作用

克里斯蒂娜·马丁·格拉纳多斯 1, 阿兰·普雷斯科特, 内尔·范德塞尔, 阿莱德·范·伊恩德, 米盖尔·始新世, 伊扎贝拉·P·克拉斯卡, 贾尼娜·格内曼, 莫妮克·贝伦斯, 马修·博伦, 约翰·福雷斯特, 科林·德·麦凯格
附属公司

PP1/NIPP1在引导人类癌细胞迁移中的作用

克里斯蒂娜·马丁·格拉纳多斯等。 公共科学图书馆一号. 2012.

摘要

电梯度存在于许多正在发育和再生的组织以及肿瘤周围。体外模拟内源性电场对许多细胞类型的行为有着深远的影响。有趣的是，特定的细胞类型以阴极方式迁移，其他类型以阳极方式迁移，还有一些以长轴垂直于电矢量的方式极化。这些引人注目的现象可能具有体内相关性，因为癌症转移期间的决定因素之一是在细胞外引导刺激下，在吸引和排斥迁移之间切换的能力。我们提供的证据表明，宫颈癌细胞系HeLa在生理强度的直流电场中阴极迁移，而强转移前列腺癌细胞系PC-3-M则阳极迁移。值得注意的是，蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶-1（PP1）及其调节因子NIPP1的遗传破坏减少了这些细胞系中的定向迁移。相反，NIPP1的诱导表达以PP1依赖的方式将HeLa细胞的定向反应从阴极转换为轻微的阳极。值得注意的是，诱导高活性PP1/NIPP1全酶，进一步将定向迁移转移到阳极。我们证明PP1与NIPP1的关联上调了GTPase Cdc42的信号传导，并证明在过度表达NIPP1细胞中对Cdc42进行药理学抑制可以恢复阴极迁移。总之，我们提供了NIPP1调节细胞定向迁移的第一个证据。此外，我们确定PP1/NIPP1是一种新的分子罗盘，通过上调Cdc42信号控制定向细胞迁移，并提出PP1/NIPP1可能有助于癌细胞迁移特性的方式。

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数字

图1
图1。PP1缺失会损害HeLa细胞的趋电性。
答：。用siRNA处理亲代HeLa-Tet-Off（HTO）细胞会在转染48小时后严重消耗PP1水平。用识别所有亚型的PP1抗体观察内源性PP1水平。B。图表显示，PP1的丢失会削弱电池向阴极迁移的能力。每条线代表单个细胞的迁移轨迹。每个细胞迁移轨迹的起点都在原点。末端位置在右侧的电池轨迹显示为红色（“C”，阴极），而在左侧的电池轨迹则显示为黑色（“A”，阳极）。作为对照，对EF处理的细胞进行分析。控制siRNA细胞强烈向阴极迁移；PP1 siRNA处理的细胞无法迁移以响应DC EF。刻度显示迁移距离，单位为µm。C、。PP1耗竭强烈降低了迁移距离、速度和方向性，以响应生理性DC EF。误差条为S.E.M。第页显示了距离、速度和方向上的显著差异值。D。用DC EF处理的对照细胞和PP1缺失细胞中内源性PP1的定位和丝状蛋白的分布。用识别所有亚型（绿色）的PP1抗体观察内源性PP1水平，并用罗丹明-指骨肽（红色）检测聚合肌动蛋白。细胞核已用DAPI（蓝色）染色。箭头标记细胞PP1水平显著下降，这与肌动蛋白丰富突起形成缺陷有关。显示了具有代表性的图像。比例尺为50µm。E.公司。通过计数100个细胞来量化丝状伪足细胞的数量。误差条为S.E.M。第页显示了显著差异的值。图像显示了控制siRNA和PP1 siRNA细胞突起的细节。箭头标记对照细胞中的大量丝足，并勾勒出PP1 siRNA细胞中细胞边缘主要缺乏丝足的区域。
图2
图2。PP1相互作用物NIPP1的缺失会损害HeLa细胞的趋电反应。
答：。用siRNA处理亲代HeLa-Tet-Off（HTO）细胞会在转染48小时后严重降低NIPP1水平。通过SDS/PAGE和免疫印迹分析细胞裂解产物。检测到对应于所有PP1亚型的条带，并将GAPDH用作负载对照。B。图表显示，NIPP1的丢失会削弱细胞向阴极迁移的能力。控制siRNA细胞强烈向阴极迁移；NIPP1 siRNA处理的细胞显示阴极反应大大降低。刻度显示迁移距离，单位为µm。图表之间的比例不同，以便包括所分析的每个细胞的轨迹。C、。NIPP1耗竭强烈降低了迁移距离、速度和方向性，以响应生理性DC EF。数据来自至少三个实验。误差条为S.E.M。第页显示了距离、速度和方向上的显著差异值。D。用DC EF处理的对照细胞和NIPP1缺失细胞中内源性NIPP1的定位和丝状蛋白的分布。内源性NIPP1水平用兔抗NIPP1抗体（绿色）识别，聚合肌动蛋白用罗丹明-阴茎肽（红色）检测。细胞核用DAPI染色（蓝色）。NIPP1定位于EF处理和未处理细胞的细胞核，其水平被siRNA耗尽。比例尺为50µm。E.公司。通过计数100个细胞来量化丝状伪足细胞的数量。误差条为S.E.M。第页显示了显著差异的值。图像显示了控制siRNA和NIPP1si RNA细胞中细胞突起的细节。箭头标记了对照细胞中的大量丝状伪足，并勾勒出NIPP1 siRNA细胞边缘主要缺乏丝状伪满的区域。
图3
图3。PP1相互作用物NIPP1的缺失会损害PC-3-M细胞的趋电反应。
答：。用IPTG处理PC-3-M细胞可诱导NIPP1耗竭。通过SDS/PAGE和免疫印迹分析细胞裂解产物。检测到PP1亚型对应的条带，并使用GAPDH作为负荷控制。B。曲线图显示，NIPP1的缺失会削弱PC-3-M细胞的无序迁移能力。对迁移轨迹进行了三个小时的跟踪。每个细胞迁移轨迹的起点都在原点。末端位置在右侧的单元格轨迹显示为红色，而在左侧的单元格轨迹则显示为黑色。当向电池施加直流EF时，阴极标记为“C”，阳极标记为“A”。控制置乱PC-3-M细胞强阳极迁移（负方向值）；表达靶向NIPP1的shRNA的细胞表现出极低的阳极反应。刻度显示偏移的距离，单位为µm。图表之间的比例不同，以便包括所分析的每个细胞的轨迹。C、。NIPP1耗竭强烈降低了对生理性DC EF的迁移距离和方向性。数据来自至少三个实验。误差条为S.E.M。第页显示了距离、速度和方向上的显著差异值。
图4
图4。NIPP1在HTO细胞中的表达以及通过其与PP1的结合控制EF诱导的定向迁移。
答：。HeLa-Tet-Off（HTO）细胞系去除强力霉素后表达的内源性NIPP1和不同的FLAG-标记NIPP1变异体卡通。所有三个NIPP1变体都有一个叉头关联域（FHA）。W.T.NIPP1中的一致PP1结合序列RVTF已突变为FLAG-mNIPP1变体中的RATA。FLAG标记的ΔC-NIPP1蛋白中不包含C末端自抑制（ID）结构域，导致组成活性PP1/NIPP1全酶的表达。B。去除多西环素后通过蛋白质印迹证实的NIPP1变体的表达。通过SDS/PAGE和免疫印迹分析细胞裂解产物。检测到PP1亚型对应的条带，并使用GAPDH作为负荷控制。C、。在EF处理和未处理的HTO细胞中，NIPP1在HTO细胞的表达和定位被ICC证实。已使用抗-FLAG抗体和罗丹明指骨肽检测FLAG标记的NIPP1变体（绿色）和F-actin（红色）。细胞核用DAPI染色。在EF处理和未处理的细胞中，NIPP1过度表达定位于细胞核。比例尺为50µm。图表显示，生理强度的EF（200 mV/mm）在表达不同NIPP1变体的HTO细胞中诱导了不同的迁移反应。EF处理的HTO细胞显示为对照。在无EF和有EF的情况下，追踪迁移轨迹三个小时。每个单元格在0小时的位置位于原点（0，0）。末端位置在右侧的单元格为红色，而在左侧的单元格为黑色。当对电池施加直流EF时，阴极标记为“C”，阳极标记为“A”。刻度显示迁移距离，单位为µm。请注意，为了包括所分析的每个细胞的轨迹，图表之间的刻度是不同的。
图5
图5。HTO细胞中的中心体极化反映了EF中的定向迁移。
答：。DC EF将中心体极化至亲代HTO细胞的阴极，如对顶部（t）、右侧（EF处理细胞的阴极）、底部（b）、左侧（EF治疗细胞的阳极）和细胞核中心（标记为白点）5个区域的细胞计数所示。B。亲代细胞和mNIPP1细胞将其中心体阴极定位在EF中，而W.T.NIPP1的过度表达会破坏阴极中心体极化，ΔC-NIPP1过度表达会将中心体的阴极极化转变为阳极极化。每例中计数100个细胞，结果以百分比表示。
图6
图6。Cdc42-GTPase对HTO细胞的药理抑制作用。
答：。ML141对在完全培养基中培养的未刺激细胞和EF刺激的过表达FLAG-NIPP1蛋白变体的HTO细胞中Cdc42 GTPase活性的影响。G-LISA在父母、W.T-NIPP1、ΔC-NIPP1和mRATA细胞中测定的Cdc42-GTP水平，在没有或存在DC EF的情况下，以及在电刺激前用10µM ML141预处理的细胞中。第页在完全培养基中，W.T-NIPP1和ΔC-NIPP1的亲本值分别为0.1和0.01；第页在所有病例中，无ML141和有ML141的样本比较值均<0.01。B。Cdc42抑制可挽救阴极极化，这与中心体定位有关。与ML141孵育的EF处理细胞迁移的定向值。Cdc42抑制挽救了因W.T-NIPP1过表达而降低的阳性细胞定向性。当用Cdc42抑制剂预处理细胞时，ΔC-NIPP1细胞显示的强负向性值接近于0。为了简化无亲本EF时的定向值，图中未包括W.T-NIPP1、ΔC-NIPP1和mNIPP1（带或不带ML141）。如果没有ML141，这些值为−0.07±0.04；0.05±0.09; −分别为0.08±0.05和−0.01±0.04；ML141为-0.07±0.04；0.09±0.05；−分别为0.07±0.05和−0.01±0.04。在没有EF值的情况下，所有病例的EF值都非常接近于0，并且四条线之间的差异在任何病例中都没有统计学意义。至少从三个实验中对数据进行了量化。误差条为S.E.M。第页显示了方向性的显著差异值。按照材料和方法中的说明计算中心体的极化指数。当用Cdc42抑制剂ML141处理细胞时，W.T.NIPP1和ΔC-NIPP1细胞的极化指数与亲代细胞的极化指标相似。
图7
图7。漫画展示了宫颈上皮的基本组织，以及解释PP1/NIPP1如何促进肿瘤细胞侵袭的机制模型。
宫颈和阴道上皮的管腔电位约为-25至-50 mV。这种管腔电位对应于1.7 V/cm（170 mV/mm）的跨上皮电压梯度。在这些电生理条件下，当子宫颈上皮细胞翻转上皮衬里层时，它们会向管腔迁移（绿色箭头）。NIPP1的上调及其向PP1的募集将逆转向管腔的迁移，鼓励周围组织的侵袭（红色箭头）。
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参考文献

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