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.2012年8月10日；287(33):27290-301.
doi:10.1074/jbc。M112.374777。 Epub 2012年6月12日。

应激诱导的骨骼肌Gadd45a表达重编程肌核并导致肌肉萎缩

斯科特·M·埃伯特 1, 迈克尔·C·迪勒, 史蒂文·德孔克尔（Steven D Kunkel）, 史蒂芬·A·布拉德, Kale S Bongers公司, 丹尼尔·福克斯, 杰森·迪尔多夫, 埃里克·福斯特, 克里斯托弗·亚当斯
附属公司

应激诱导的骨骼肌Gadd45a表达重编程肌核并导致肌肉萎缩

斯科特·M·埃伯特等。 生物化学杂志. .

摘要

包括饥饿和肌肉废用在内的各种应激会导致骨骼肌萎缩。然而，肌肉萎缩的分子机制是复杂的，也不太清楚。在这里，我们证明生长停滞和DNA损伤诱导的45a蛋白（Gadd45a）是肌肉萎缩的关键介质。我们通过无偏见地寻找应激诱导的促营养转录因子ATF4的潜在下游介体来鉴定Gadd45a。我们表明，Gadd45a是由三种不同的骨骼肌应激引起的骨骼肌萎缩所必需的：禁食、肌肉制动和肌肉失神经。相反，在没有上游压力的情况下，肌肉或培养的肌管中强制表达Gadd45a会导致萎缩。我们表明，肌肉特异性ATF4基因敲除小鼠在应激反应中诱导Gadd45a mRNA的能力降低，因此，它们在禁食或肌肉制动反应中萎缩较少。有趣的是，Gadd45a是一种诱导肌核重构的肌核蛋白，是一种治疗肌肉萎缩的综合方案。Gadd45a抑制参与合成代谢信号和能量生成的基因，并诱导促营养基因。因此，Gadd45a减少了肌肉萎缩的多重屏障（包括PGC-1α、Akt活性和蛋白质合成），并刺激促营养机制（包括自噬和caspase介导的蛋白水解）。这些结果阐明了一种关键的应激诱导途径，该途径可重新编程肌肉基因表达，从而导致萎缩。

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数字

图1。
图1。
ATF4的缺失延迟了由禁食或固定引起的骨骼肌萎缩。 A–C允许使用ATF4 mKO小鼠和窝友对照随意获取食物或禁食24小时或48小时，除去食物而不是水。**，第页< 0.01. *,第页< 0.05.一个TA肌肉重量。每个数据点代表≥9只小鼠的平均值±S.E。B类TA肌纤维大小在无禁食和有禁食的情况下各48小时。左侧，平均纤维直径±S.E。赖特，纤维尺寸分布。数据来自每TA≥250条肌肉纤维，每种情况≥3只小鼠。C、，代表性H&E污渍来自出生日期-出生日期，ATF4 mKO小鼠和窝友对照组接受单侧TA制动0、3或7天。D、，TA肌肉重量。在每只小鼠中，静止（萎缩）TA的重量被标准化为移动（非萎缩）TA重量，设置为1。每个数据点代表≥10只小鼠的平均值±S.E.。*，第页< 0.01.E类，代表性H&E污渍来自D.F、，TA肌纤维大小。在每只小鼠的每个TA中，测量了≥350条肌肉纤维，并且将固定TA中的平均纤维直径标准化为移动TA中的纤维平均直径，将其设置为1。每个数据点代表≥5只小鼠的平均值±S.E.。*，第页< 0.05.
图2。
图2。
的标识加德45a作为一种转录物，在ATF4 mKO肌肉中减少，在小鼠肌肉和培养的C2C12肌管中由于ATF4过度表达而增加。 A–C，ATF4而非ATF4ΔbZIP导致C2C12肌管萎缩。如图所示，用单独表达eGFP（Ad-GFP）、eGFP+ATF4（Ad-ATF4）或eGFP+ATF4ΔbZIP（Ad-AFT4Δb ZIP）的腺病毒感染肌管，然后在感染48小时后收获。ATF4构建物含有FLAG表位标签。A、，用抗FLAG单克隆IgG对总细胞蛋白提取物进行免疫印迹分析。B类，具有代表性的图像。C、，3个实验的平均肌管直径±S.E。第页这些值是通过单向方差分析和Dunnett的后验确定的，第页< 0.01.D、，Affymetrix小鼠外显子1.0 ST阵列用于识别因肌管中ATF4过度表达而增加的mRNA（Ad-ATF4与Ad-ATF4ΔbZIP），因禁食小鼠TA肌肉（ATF4 mKO小鼠）中ATF4的丢失而降低与并且在C57BL/6 TA肌肉中ATF4过度表达（ATF4质粒与空的pcDNA3质粒）。n个每个条件下≥3个阵列，统计显著性任意定义为第页≤0.01乘以t吨测试。数字指出每个类别中的转录本数量。E、，qPCR证实ATF4增加加德45a肌管中的mRNA。数据标准化到加德45aAd-GFP感染的肌管中的mRNA，为3个实验的平均值±S.E.。*，第页< 0.05.F、，qPCR证实ATF4 mKO肌肉含有减少加德45amRNA。小鼠禁食24小时，然后采集TA肌肉进行qPCR分析。ATF4 mKO肌肉中的mRNA水平被标准化为窝友对照肌肉中的水平。数据为每个基因型10只小鼠的平均值±S.E.。*，第页< 0.05.
图3。
图3。
Gadd45a是由制动、禁食和失神经引起的骨骼肌纤维萎缩所必需的。 一个和B类，Gadd45a是制动诱导的肌纤维萎缩所必需的。第0天，用20μgp-miR-控制或20μgp-miR-Gadd45a型，如图所示。所有质粒均携带EmGFP作为转染标记。第3天，右后肢被固定。第10天，采集双侧TA肌肉进行分析。A、 上部面板，mRNA水平通过qPCR测定，并归一化为流动，p-mir-控制-转染TA；数据为每种情况下3块肌肉的平均值±S.E。左下方，每种条件下5个TA的平均纤维直径±S.E。右下方，纤维尺寸分布。使用线性混合模型确定统计差异，并对小鼠产生随机效应（58）。不同的字母在统计上是不同的(第页≤ 0.05).B、，代表性图像。C、，禁食诱导的肌肉纤维萎缩需要Gadd45a。第0天，用20μgp-miR-控制（左腿）或20μgp-miR-Gadd45a型（右腿）。第9天，小鼠禁食24小时，然后收获用于分析。左侧，每种条件下≥4个TA的平均纤维直径±S.E.。*，第页< 0.01.赖特，纤维尺寸分布。D、，Gadd45a是失神经诱导的肌肉萎缩所必需的。第0天，用20μgp-miR-控制或20μgp-miR-Gadd45a型第3天，切断左侧坐骨神经。第10天，采集双侧TA肌肉。左侧，每种条件下≥5个TA的平均纤维直径±S.E。采用线性混合模型确定统计差异，并对小鼠产生随机效应；不同的字母在统计上是不同的(第页≤ 0.05).赖特、纤维尺寸分布。E类，Gadd45a是ATF4介导的肌肉萎缩所必需的。向C57BL/6 TA肌肉转染10μg对-ATF4-FLAG+20μg或p-miR-对照（左TA）或20μgp-miR-Gadd45a型（右TA），10天后收获。左侧，每个条件下5个TA的平均纤维直径±S.E.。*，第页= 0.03.赖特，纤维尺寸分布。
图4。
图4。
Gadd45a过度表达导致肌管萎缩在体外骨骼肌纤维萎缩体内. A–C，用所示腺病毒感染C2C12肌管，然后在感染48小时后进行测量和收获。Ad-Gadd45a是共表达eGFP和Gadd45a-FLAG的腺病毒。一个用抗FLAG单克隆IgG进行免疫印迹分析。B类，具有代表性的图像。C、，3个实验的平均肌管直径±S.E.。*，第页< 0.01.D类和E、，向C57BL/6 TA肌肉转染2μgp-eGFP+20μg空载体(pcDNA3型；左TA）或20μgp-Gadd45a-标记（右TA），10天后收获。D、，肌肉蛋白提取物用抗FLAG单克隆IgG进行免疫印迹分析。E、，肌肉纤维大小。左侧，3个实验的平均纤维直径±S.E.。*，第页< 0.02.赖特，纤维尺寸分布。F类和G、，将ATF4 mKO TA肌肉转染为D类和E类7天后收获。F、，3个实验的平均纤维直径±S.E，第页< 0.01.G、，代表性图像。
图5。
图5。
Gadd45a是一种肌核蛋白，可改变肌核结构并重新编程骨骼肌基因表达。 一个和B、，肌管细胞核中FLAG标记的Gadd45a的免疫组织化学检测(一个)和骨骼肌纤维核(B类)。在一个免疫组化前，肌管感染Ad-Gadd45a 48h。在B类，用2μg的p-eGFP+20微克p-Gadd45a-标记10天后取标本进行免疫组化。C类和D、，Gadd45a以类似于肌肉失神经的方式改变肌核形态。C类切断C57BL/6小鼠左侧坐骨神经，7天后取双侧TA肌进行TEM分析。顶部，具有代表性的图像。底部，去神经支配对小直径肌细胞核的影响。数据为每种情况下>50个肌核的平均值±S.E.。*，第页< 0.01.D、，C57BL/6 TA肌肉转染20μgpcDNA3型（左TA）或20μg对Gadd45a-FLAG（右TA），7天后收获用于TEM分析。顶部，具有代表性的图像。底部，Gadd45a对较小直径的肌细胞核的影响。数据为每种情况下>30个肌核的平均值±S.E.。*，第页< 0.01.E、，失神经和Gadd45a对骨骼肌mRNA水平的影响。为了确定去神经支配的效果，切断C57BL/6小鼠左侧坐骨神经，7天后取双侧TA肌。然后用外显子表达阵列测量双侧TA肌肉mRNA水平，并将失神经肌肉中的水平归一化为对侧神经肌肉的水平。为了确定Gadd45a的作用，将ATF4 mKO TA肌肉转染并收获，如D类然后用外显子表达阵列测量双侧TA肌肉mRNA水平，并将Gadd45a转染肌肉中的水平归一化为对侧对照肌肉的水平。n个=每个条件4个数组。统计显著性定义为第页成对≤0.01t吨测试。E、，去神经支配显著改变了1674个mRNAs的水平（在测量的>16000个mRNA中）。饼图显示了失神经和Gadd45a对这些mRNA的影响。
图6。
图6。
Gadd45a降低PGC-1α、线粒体、Akt活性和蛋白质合成，并增加自噬和半胱氨酸蛋白酶介导的蛋白水解。 A、，Gadd45a降低PGC-1α并增加脂质LC3和caspase-3蛋白。C57BL/6 TA肌肉转染20μgpcDNA3型（左TA）或20μgp-Gadd45a-标记（右TA），10天后收获，用所示抗体进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。左侧，代表性免疫印迹。赖特，量化。在每个肌肉中，PGC-1α、LC3-II和胱天蛋白酶-3信号被标准化为肌动蛋白信号，在每个小鼠中，存在Gadd45a的水平被标准化为不存在Gadd45a的水平。数据为4只小鼠的平均值±S.E.。*，第页< 0.05.B、，Gadd45a减少线粒体DNA。C57BL/6 TA肌肉被转染并收获，如一个用于线粒体DNA（mtDNA）的qPCR分析，其归一化为同一肌肉中的核DNA（nDNA）数量。数据为7只小鼠的平均值±S.E.。*，第页< 0.02.C、，Gadd45a降低Akt和GSK-3β磷酸化。用对照病毒（Ad-ATF4ΔbZIP）或Ad-Gadd45a感染C2C12肌管，48小时后收获，用所示抗体进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。左侧，代表性免疫印迹。赖特，量化。将磷蛋白-Akt和磷蛋白-GSK-3β信号归一化为来自同一样品的肌动蛋白信号。然后将Ad-Gadd45a感染的肌管中的水平归一化为对照肌管的水平。数据为4个实验的平均值±S.E.。*，第页< 0.05.D、，Gadd45a减少蛋白质合成。C2C12肌管感染对照病毒（Ad-ATF4ΔbZIP）或Ad-Gadd45a。48小时后通过测量[三H] 亮氨酸掺入。然后将Ad-Gadd45a感染的肌管中的水平归一化为对照肌管的水平。数据为5个实验的平均值±S.E.。*，第页< 0.01.E、，Gadd45a增加蛋白质水解。C2C12肌管与[三H] 酪氨酸20小时，用培养基洗涤2小时，然后在新鲜培养基中感染对照病毒（Ad-ATF4ΔbZIP）或Ad-Gadd45a。36小时后通过测量[三H] 酪氨酸释放。然后将Ad-Gadd45a感染的肌管中的水平归一化为对照肌管的水平。数据为平均值±S.E。；n个= 8. *,第页< 0.05.F、，Gadd45a诱导自噬体形成。C57BL/6 TA肌肉转染为一个7天后收获进行TEM分析。G、，Gadd45a增加caspase介导的蛋白水解。转染C57BL/6 TA肌肉，并按一个，然后检测caspase介导的蛋白水解。在每只小鼠中，存在Gadd45a的水平被标准化为不存在Gadd45的水平。数据为7只小鼠的平均值±S.E.。*，第页< 0.01.
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