Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging

doi:10.1038/nmeth.1768

.2011年11月6日；8(12):1027-36.

doi:10.1038/nmeth.1768。

荧光灯在基于定位的超分辨率成像中的最佳性能评估

格雷厄姆·邓普西¹, 约书亚·C·沃恩, 陈国浩, 马克·贝茨, 庄晓伟

附属公司

PMID： 22056676
预防性维修识别码： PMC3272503项目
内政部： 10.1038/nmeth.1768

荧光灯在基于定位的超分辨率成像中的最佳性能评估

格雷厄姆·邓普西等人。 Nat方法. 2011.

.2011年11月6日；8(12):1027-36.

doi:10.1038/nmeth.1768。

作者

格雷厄姆·邓普西¹, 约书亚·C·沃恩, 陈国浩, 马克·贝茨, 庄晓伟

附属

¹美国马萨诸塞州剑桥哈佛大学生物物理研究生课程。

PMID： 22056676
预防性维修识别码： PMC3272503项目
内政部： 10.1038/nmeth.1768

摘要

一种超分辨率荧光成像方法使用单个荧光团的顺序激活和定位来实现高空间分辨率。这项技术的关键是荧光探针的选择；探针的性质，包括每个开关事件的光子、开关占空比、光稳定性和开关循环次数，在很大程度上决定了超分辨率图像的质量。尽管已经报道了许多探针，但仅在少数情况下描述了这些探针特性的系统表征及其对超分辨率图像质量的影响。在这里，我们定量地表征了26种有机染料的切换特性，并将这些特性与超分辨率图像的质量直接相关。该分析为超分辨率探针的特征描述提供了指南，并为基于性能选择探针提供了资源。我们的评估确定了几种在四个独立光谱范围内具有良好到优异性能的光开关染料，利用这些染料我们演示了低串扰、四色超分辨率成像。

PubMed免责声明

数字

**图1。基于单分子定标的超分辨率成像原理和用于该成像方法的切换模式**
(一)小于衍射极限分辨率的结构（此处为环状物体）被密集地标记为可切换荧光团。当荧光团同时成像时，每个分子的重叠荧光图像掩盖了结构的空间特征。然而，当分子被激活并按顺序成像时，可以高精度地确定单个分子的位置（荧光图像显示为红色圆圈，其中心位置标记为黄色“+”）。通过反复激活和定位标记结构的不同分子，可以解决亚衍射的空间特征。(b条)这一原理可以通过使用光开关或非光开关模式来实现。第一模式还包括可可逆切换或不可逆激活的荧光团。例如，可以通过荧光标记配体的可逆结合或荧光的化学猝灭来实现非光开关模式。

**图2。STORM成像的定量探针表征**
(一–**c（c）**)对于示例结构（环形物体），每个开关事件检测到的光子数和开/关占空比（打开状态下的时间分数）对STORM图像质量的影响。(一)具有高光子数和低占空比的荧光灯可以产生空心的环形图像，具有较高的定位精度和足够的密度。(b条)低光子数和低占空比的荧光团保持了大量的定位，但定位精度降低，模糊了环形结构。(**c（c）**)具有高开关占空比的荧光团需要降低荧光探针的密度，以实现单分子定位，这反过来会减少定位数量，并对整体分辨率产生不利影响。在βME和氧清除系统存在下测量的单分子荧光时间痕迹，如三种红色吸收染料所示(d日)Alexa亚历克赛647(电子)至655，以及(**（f）**)Cy5.5周期。这些染料中的每一种都代表了(**a–c**). 根据这些轨迹，确定每个开关事件的检测光子数，并根据数百个分子的许多事件构建直方图(克，我，k个). 指示的平均值是根据分布的单指数拟合得出的（红色曲线）。计算每种染料的开/关占空比值，并绘制与时间的关系曲线（红色曲线；小时，j，我)显示当大多数分子处于荧光状态并在稍后达到准平衡时，每个值是如何开始变高的。报告的值是在400–600秒之间测量的平均占空比（灰色框）。幸存于光漂白的分子分数与占空比一起绘制（蓝色方块）。使用三种染料拍摄的3D氯氰菊酯涂层凹坑（CCPs）图像。(**百万英镑**)Alexa亚历克赛647(**q–t**)附件655，以及(**u–x**)周期5.5。中显示的大视场(**m、 q、u**)是2D投影图像。黄色虚线框所示CCP的图像被放大*xy公司*横截面(n个，第页，**v（v）**)和*x赫兹*横截面(**o（o）**，秒，w个)如图所示。复合材料*xy公司*图中显示了十个与各自质心对齐的CCP的横截面，以及由复合材料导出的局部径向密度分布*xy公司*横截面(第页，t吨，x个). 比例尺为500 nm(米，问，u个)和100 nm(**n–p**，**r–t型**，**v–x**).

**图3。Alexa 647和Dyomics 654解决了免疫染色微管的中空结构**
(**a–b**)Alexa 647免疫染色微管的STORM图像(一)和动力学654(b条)以及部分覆盖在每个图像左上角的常规荧光图像。(**c–d码**)对应于中黄盒区域的定位的横剖面(**a–b**)说明灯丝的空心圆柱形结构，中心有明显的倾斜（顶板对应于(一)底部面板对应于(b条)). 通过两个高斯函数（红线）对轮廓进行拟合，得出了两个峰值之间的预期距离。比例尺：250 nm。

**图4。四色STORM图像*在体外*组装微管丝及其串扰分析**
(一)的四色STORM图像*在体外*组装好的微管分别标记有四种染料：Atto 488（绿色）、Cy3B（洋红）、Alexa 647（青色）和DyLight 750（白色）。(b条)四种染料的光谱分离，黑色垂直线表示所使用的激发波长，灰色区域突出显示中每种染料的发射滤光片范围(**c–f**). (**c–f**)每个光谱区域中装箱区域的单个STORM图像(一). (克)从控制微管样品测量的通道之间的串扰（参见方法部分了解详细信息）。星号表示在这些通道中无法检测到串扰。比例尺：2µm(一)和500 nm(**c–f**).

**图5。细胞结构的四色STORM成像**
(**a–d**)单个固定细胞内Atto 488标记微管（绿色）、Cy3B标记线粒体（洋红色）、Alexa 647标记ER（青色）和DyLight 750标记乙酰化微管蛋白（白色）的四色图像的单个通道。每个面板中的黄色虚线框对应于图像中的相同区域。(电子)放大中黄盒区域的Cy3B和Alexa 647通道(**a–d**)显示线粒体和内质网之间广泛接触(**（f）**)同一区域的Atto 488和DyLight 750通道的放大显示乙酰化微管蛋白与微管丝子集重叠。比例尺：1µm(**a–d**)和500 nm(**e–f**).

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