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.2011年12月；32(12):1806-14.
doi:10.1093/carcin/bgr216。 Epub 2011年9月28日。

MEK1/MT1-MMP轴的分级激活决定肾上皮细胞肿瘤表型

拉杰夫·马希姆卡尔 1, 玛丽亚·亚历杭德拉·阿方索·杰姆, 莱斯利·M·开普, 拉杰维尔·达希亚, 大卫·H·洛维特
附属机构

MEK1/MT1-MMP轴的分级激活决定肾上皮细胞肿瘤表型

拉杰夫·马希姆卡尔等。 致癌作用. 2011年12月.

摘要

Raf/Ras/丝裂原活化蛋白激酶（MEK）/丝裂素活化蛋白激酶信号通路的激活和膜型1基质金属蛋白酶（MT1-MMP）的高表达与肾癌中von Hippel-Lindau基因的改变有关。我们假设MEK激活的程度与MT1-MMP的分级表达以及由此产生的肾上皮肿瘤表型有关。用MEK1表达质粒转染的Madin Darby犬肾上皮细胞产生了形态表型从上皮、混合上皮/间充质到间充质的群体。分析克隆的MEK1活性、MT1-MMP表达和上皮-间质转化程度。用nu/nu小鼠在体内评估MDCK-MEK1克隆的表型。定量评估肾细胞癌组织微阵列中磷酸化MEK1和MT1-MMP蛋白的表达以及与Fuhrman核分级的相关性。MEK信号模块的分级增加与MDCK细胞上皮-间充质转化的分级诱导以及MT1-MMP转录和合成的诱导有关。抑制MEK1和MT1-MMP活性可逆转上皮-间质转化。由上皮、上皮/间充质和间充质混合MDCK克隆产生的肿瘤表现出一种表型梯度，从分化良好、完全包裹的非侵袭性肿瘤扩展到具有间变性形态、高Fuhrman核评分、新生血管生成和侵袭性的肿瘤。肿瘤微阵列显示磷酸化MEK1、MT1-MMP表达的程度与核分级之间具有统计学意义的相关性。我们得出结论，MEK1信号模块的分级增加与M1-MMP表达、肾上皮细胞肿瘤表型、侵袭活性和核分级相关。磷酸化MEK1和MT1-MMP可能是评估肾细胞癌的新的、机制性的生物标志物。

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数字

图1。
图1。
具有上皮-间充质转化梯度的MDCK克隆的生成和表征。第一组：用组成活性MEK1稳定转染MDCK细胞，并用潮霉素筛选，详见材料和方法。克隆来自挑选的单个细胞，通过相差显微镜显示出形态表型的梯度，从完全上皮（B）到混合中间表型（C和D），再到成纤维细胞间充质表型（E和F）。A组是仅用pTK-hydro转染的对照MDCK克隆。第二组：MDCK克隆的E-钙粘蛋白免疫荧光（IF）染色。E-钙黏蛋白随着上皮-间充质转化程度的增加逐渐从连接复合体中丢失，主要呈胞质和核周分布，尤其是在大多数间充质E和F克隆中。第三组：波形蛋白MDCK克隆的IF染色。在上皮克隆中，波形蛋白位于皮层下分布，但随着上皮-间充质转化的进行，出现密集的细胞绞痛和核周染色，波形素排列成线状束（I–III，×200）。第四组：MDCK克隆中波形蛋白的Western blot分析。随着上皮-间充质转化程度的增加，MDCK克隆中波形蛋白的表达逐渐增加。
图2。
图2。
定量分析MEK1活性、MT1-MMP转录率、蛋白质合成、MT1-MM酶活性和侵袭。第一组：在相应的MDCK克隆中测量MEK1酶活性，将100%的值分配给对照上皮克隆a（灰色柱）。使用小鼠MT1-MMP启动子驱动报告荧光素酶盒（黑色柱；数据表示为每个克隆四倍测定值的平均值±SD），按照材料和方法中的详细说明评估MT1-MMP转录活性。图II：MDCK克隆细胞提取物对MT1-MMP的蛋白质印迹分析。检测到的主要MT1-MMP带具有原酶形式的表观分子量（62kDa）。第三组：MDCK细胞提取物的MT1-MMP酶定量分析，详见材料和方法。结果显示为ng活性MT1-MMP蛋白/100μg细胞提取物（平均值±1 SD）。第四组：使用基于胶原蛋白的细胞侵袭试剂盒，按照材料和方法中的详细说明，对相应的对照和MEK1-MDCK克隆进行侵袭活性检测（数据表示为四次测定的平均值±SD*P（P）<0.05到t吨-测试）。
图3。
图3。
MEK1和MT1-MMP酶活性需要维持MEK1诱导的上皮-间充质转化。第一组：间充质克隆F与选择性MEK1抑制剂PD98059（30μM）孵育48小时，然后进行HA-MEK1表位标签的免疫荧光染色。（A） 对照克隆F细胞表现出扩展的迁移表型和明亮的MEK1染色。（B） PD98059处理的细胞通过持续MEK1蛋白染色（×300）显示出完全上皮表型的逆转。第二组：间充质MDCK克隆F与对照IgG或针对MT1-MMP催化位点的单克隆抗体孵育。用抗MT1-MMP抗体孵育96小时可将波形蛋白和E-钙粘蛋白的分布恢复为上皮表型。（×300）第二组：用对照IgG或抗MT1-MMP抗体处理的克隆F细胞的波形蛋白和E-cadherin的Western blot。E-cadherin表达暂时增加，vimentin表达暂时减少。
图4。
图4。
的特征体内由MDCK-MEK1克隆产生的肿瘤。第一组：将上皮细胞克隆B、中间克隆D和全间充质细胞克隆F的培养物悬浮在Matrigel中，并皮下注射到裸鼠两侧数值/数值材料和方法中详述的小鼠。在4周时切除肿瘤进行分析。上皮性克隆B衍生肿瘤（A–C）具有典型的高分化腺癌特征，其位于具有相对无细胞基质的致密包膜内。中间表型克隆D衍生肿瘤（D–F）包裹在致密的包膜中，但比克隆B衍生肿瘤的细胞数量更多。间充质表型克隆F衍生肿瘤是高度细胞性肿瘤，具有间变性形态（箭头，I），具有局部浸润和新生血管生成（箭头，H）（A、D和G×40；B、E和H×200；C、F和I×400）。第二组：来源于上皮克隆B中间表型克隆D和全间充质表型克隆F的肿瘤进行MT1-MMP染色，详见材料和方法。（A） 抗体阴性对照。（B） 克隆B源性肿瘤中未检测到MT1-MMP染色。（C） 在中间克隆D肿瘤中，上皮囊性结构中的细胞偶尔出现MT1-MMP染色（箭头所示）。（D） 高度侵袭性克隆F衍生肿瘤的细胞染色强烈，侵袭性细胞柱染色显著（箭头）（×200）。
图5。
图5。
VHL状态与MT1-MMP转录的关系以及EGFR和MET抑制的合成效应。第一组：在存在或不存在EGFR抑制剂4557w（2.5μM）或MET抑制剂K252a（10 nM）的情况下，用MT1-MMP荧光素酶报告子构建物瞬时转染VHL+/+Caki-1和VHL−/−786-O透明细胞癌细胞。48小时后，对细胞进行裂解并测定荧光素酶活性。以三份至四份测量的平均值±SD表示的数据，其中对照pGL3载体的相对活性为100%。(*P（P）<0.05，与未经处理的MT1-Luc活性相比t吨-测试）。第二组：Caki-1和786-0细胞裂解物的Western blot分析，在4557w、K242a或组合存在或不存在的情况下培养48小时。
图6。
图6。
对肾癌组织微阵列切片的代表性切片进行磷酸-MEK1和MT1-MMP染色，并定量评估磷酸-MEK1和MT1-MMP表达作为核分级的函数。第一组：按照材料和方法中的详细说明，对组织微阵列进行荧光-MEK1和MT1-MMP染色。在Furhman核分级较高（×200）的肿瘤中，磷酸化MEK1和MT1-MMP表达增加。第二组：对数字化免疫组织学图像进行荧光-MEK1和MT1-MMP表达定量，详见材料和方法，并根据核分级进行分析。中间值由黑色中心线表示，四分位范围（第一和第三个四分位）是方框的边缘。晶须表示Q1−1.5×四分位范围和Q3+1.5×四分位数范围。肿瘤分级与荧光素-MEK1和MT1-MMP显著相关(第页= 0.44/P（P）=0.002和第页= 0.56/P（P）分别<0.0001，Spearman相关系数）。
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