Suppression of apoptosis inhibitor c-FLIP selectively eliminates breast cancer stem cell activity in response to the anti-cancer agent, TRAIL

doi:10.1186/bcr2945

.2011年9月14日；13（5）：R88。

doi:10.1186/bcr2945。

抑制凋亡抑制剂c-FLIP选择性地消除乳腺癌干细胞对抗癌药物TRAIL的反应

卢克·皮戈特¹, 内德·奥米德瓦尔, 萨尔瓦多·马丁·佩雷斯, 瑞安农法语, 马蒂亚斯·埃贝尔, 理查德·W·E·克拉克森

附属公司

PMID： 21914219
PMCID公司： PMC3262200型
内政部： 1945年10月186日

抑制凋亡抑制剂c-FLIP选择性地消除乳腺癌干细胞对抗癌药物TRAIL的反应

卢克·皮戈特等。乳腺癌研究. 2011.

.2011年9月14日；13（5）：R88。

doi:10.1186/bcr2945。

作者

卢克·皮戈特¹, 纳德奥米德瓦尔, 萨尔瓦多·马丁·佩雷斯, Rhiannon法语, 马蒂亚斯·埃贝尔, 理查德·W·E·克拉克森

附属

¹英国威尔士加的夫市博物馆大道加的夫大学生物科学学院生命科学大楼，CF10 3AX。

PMID： 21914219
PMCID公司： PMC3262200型
内政部： 1945年10月186日

勘误表in

勘误表：抑制凋亡抑制剂c-FLIP选择性地消除乳腺癌干细胞对抗癌药物TRAIL的反应。
Piggott L、Omidvar N、MartíPérez S、French R、Eberl M、Clarkson RW。 Piggott L等人。乳腺癌研究，2015年7月16日；17(1):96. doi:10.1186/s13058-015-0597-9。乳腺癌研究，2015。 PMID：26177636 免费PMC文章。没有可用的摘要。

摘要

简介：据推测，乳腺癌干细胞（bCSCs）介导疾病复发并促使远处转移的形成，而远处转移是乳腺癌患者死亡的主要原因。然而，bCSC的治疗靶向性受到其异质性和对现有治疗药物的耐药性的阻碍。为了确定从乳腺癌中选择性去除bCSC的策略，无论其临床亚型如何，我们寻求一种靶向bCSC但不会杀死正常细胞的凋亡机制。凋亡抑制剂细胞FLICE-Like Inhibitory Protein（c-FLIP）的抑制使乳腺癌细胞对抗癌药物肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）部分敏感。在此，我们证明在乳腺癌细胞系中，bCSC对这种促凋亡途径的去表达非常敏感，从而显著减少实验性转移和bCSC自我更新能力的丧失。

方法：通过siRNA（FLIPi）在四种乳腺癌细胞系中抑制c-FLIP，并通过条件基因敲除在小鼠乳腺中进行。这些细胞对TRAIL的敏感性是通过补充细胞凋亡测定来确定的，包括一种新型的异型细胞测定，而癌症干细胞亚群的肿瘤启动潜力是通过乳腺球培养、醛化荧光测定和体内移植来确定的。

结果：c-FLIP的基因抑制导致TRAIL耐药癌细胞对TRAIL促凋亡作用的部分敏感性，而不管其细胞表型如何，但正常乳腺上皮细胞仍然无法被杀死。虽然在TRAIL/FLIPi治疗后，10%至30%的癌细胞群仍然存活，但随后的乳腺和脱氟检测表明，这种促凋亡刺激选择性地针对功能性bCSC池，消除了干细胞更新。这最终导致原发性肿瘤减少80%，移植后转移减少98%。残余肿瘤起始能力的复发与治疗后贴壁培养物在体外重新获得bCSC样特性的观察结果一致。然而，重要的是，重复TRAIL/FLIPi治疗后，这种复发性bCSC活性减弱。

结论：我们描述了一种细胞凋亡机制，该机制可选择性地反复去除乳腺癌细胞系中的bCSC活性，并表明TRAIL/FLIPi联合治疗可防止多种乳腺癌亚型的转移性疾病进展。

PubMed免责声明

数字

图1
**FLICE-Like Inhibitoring Protein（c-FLIP）抑制不会诱导非肿瘤性乳腺细胞的细胞死亡**.A类、从处女或妊娠14天的β-乳球蛋白（BLG）-Cre/c-FLIP中切除的小鼠乳腺的血红素/曙红染色切片^+/+或BLG-Cre/c-FLIP^{飞行/飞行}动物。图片代表每组四只动物。B类，从BLG-Cre/c-FLIP中分离出的乳腺上皮细胞^{飞行/飞行}（Flip-floxed）和c-Flip^+/+（WT）动物在原代细胞培养中生长，并在存在或不存在100 ng/ml可溶性（小鼠）肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）的情况下孵育18小时。使用cellTiter blue活性测定分析细胞活性。C类用FLIP siRNA（FLIPi）或对照siRNA（SCi）转染EPH4（非肿瘤性）和N202.1A（肿瘤性）细胞48小时，然后去除培养基，添加含有或不含有100 ng/ml小鼠TRAIL的新鲜培养基18小时，并按照方法所述通过流式细胞术评估细胞死亡。D类，MCF10A（非肿瘤）细胞根据C使用20 ng/ml人TRAIL进行处理和分析。

图2
**c-FLIP对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）致敏乳腺癌细胞株的抑制作用**.A类，细胞系与20 ng/ml可溶性TRAIL孵育18小时，并通过cellTiter Blue活性测定评估细胞活性。存活率以每个细胞系未经处理的对照组的百分比表示（*：对< 0.01,n个= 3).B类将用c-FLIP siRNA预处理的PKH67染色细胞和用对照siRNA预治疗的PKH26染色细胞混合并在完全培养基+/-20 ng/ml TRAIL中共同培养18小时，并通过流式细胞术评估活/死细胞（参见补充图S2）。在每个细胞系中，绘制了cFLIP siRNA细胞的细胞死亡百分比相对于其干扰siRNA对照的增加。分别绘制TRAIL处理的共培养物（白色条）和TRAIL未处理的共培育物（黑色条）。每种共培养在三个独立的实验中重复进行=对对于c-FLIP siRNA和扰乱siRNA对照之间的细胞死亡百分比增加，<0.01。*=对TRAIL治疗组与未治疗组共培养组之间c-FLIP siRNA介导的死亡差异<0.01。C类，细胞按B处理，并设置门控，以给出处理后剩余活细胞的百分比。FT=c-FLIP siRNA。

图3
**FLIPi/TRAIL治疗抑制乳腺增生形成并阻止乳腺增生形成单位的自我更新**.A类在c-FLIP siRNAi（FLIPi）或对照siRNA（SCi）转染后，在存在或不存在20ng/ml TRAIL的低血清非粘附培养条件下，以4000个细胞/孔（20000个细胞/ml）的密度对细胞系进行铺板。图片代表了所观察到的乳房球形成单位（MFU）。B类在培养7天后，对每个条件下的三个重复孔中的哺乳动物进行计数（第1段）。使用胰蛋白酶分离哺乳动物，在没有TRAIL的情况下以2000个细胞/孔（10000个细胞/ml）的密度传代，并在培养7天后进行计数（第2代）。结果是根据所播种的细胞总数中乳房球形成单位的百分比进行计算的，并且是三个独立实验的代表。C类将siRNA-转染的SKBR3和BT474细胞经+/-20 ng/ml TRAIL处理18小时，然后通过流式细胞术评估存活的粘附单层的脱氟活性。图表表示在三个独立实验中，氟醛活性阳性细胞的百分比(*对与SCi对照组相比<0.01）。

图4
**c-FLIP公司_L（左）但不是c-FLIP_S公司敲低使乳腺癌干细胞对TRAIL敏感**BT474和MDA-MB-231细胞转染siRNA序列，这些siRNA序列针对短或长c-FLIP亚型（FLIPi）或对照siRNA（SCi）。然后将细胞置于乳腺培养物中，并用20 ng/ml TRAIL处理。

图5
**贴壁培养中肿瘤干细胞对TRAIL的敏感性**.A类TRAIL敏感的MDA-MB-231细胞系受到TRAIL浓度增加的影响，孔内caspase-8活性被绘制为caspase-Glo分析获得的相对发光。用siRNA（FLIPi和SCi）转染细胞系，并在存在或不存在1 ng/ml TRAIL的情况下，如图3所示在乳腺条件下进行电镀。如图3所示，图表表示在培养7天（第1段）和胰酶消化和再交配7天后形成的乳房球（MFU）的百分比（第2段）。B类，转染siRNA的细胞系在贴壁单层培养中，用或不用TRAIL处理18小时。存活细胞群以20000个细胞/ml接种在低血清、非粘附培养条件下。如前所述，计算乳房球形成单位百分比（MFU）。

图6
**FLIPi/TRAIL抑制肿瘤初始化和转移潜能体内**.A类，BT474细胞转染c-FLIP siRNA（FLIPi）或对照siRNA（SCi），1×10⁶在存在或不存在100 ng/ml TRAIL的情况下，将细胞原位移植到存在全身雌二醇的裸鼠腹部乳腺脂肪垫中。监测移植部位，每周两次测量可触及的肿瘤。B类用20 ng/ml的TRAIL处理FLIPi转染的BT474细胞18小时，然后收集存活的贴壁细胞，并在乳腺细胞培养（TRAIL/FLIPi处理1）或贴壁条件下以20000个细胞/ml的密度重新镀膜。培养4周后，将贴壁细胞培养物重新处理为FLIPi或SCi和20 ng/ml TRAIL（18小时），然后再进行乳腺检测（TRAIL/FLIPi治疗2）。图片显示了在SCi条件下形成的乳房球体。C类, 1 × 10⁶将FLIPi（FT）或SCi（SC）处理的MDA-MB-231细胞，+/-100ng/ml TRAIL（T），注射到BALB/c严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠的尾静脉中。每天监测小鼠并在术后6周处死，以进行肺转移的组织学检查。

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