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。2011年6月3日；286(22):19993-20004.
doi:10.1074/jbc。M111.231324。 Epub 2011年4月11日。

P2X4和γ-氨基丁酸A型受体之间的交叉作用决定了中枢突触的突触效能

杨焕乔 1, 艾曼纽尔·多尼尔, 奥黛丽·马丁内斯, 莫里斯·加雷特, 埃斯特尔·图尔梅, 埃里克·布埃-格拉博特
附属机构

P2X4和γ-氨基丁酸A型受体之间的交叉作用决定了中枢突触的突触效能

杨焕乔等。 生物化学杂志。 。

摘要

神经元功能的本质是根据突触电位产生输出。突触后位置的突触整合决定了中枢神经系统的神经元输出。利用免疫组化和电生理方法，我们首次发现下丘脑腹内侧核中的类固醇生成因子1（SF-1）绿色荧光蛋白（GFP）阳性神经元表达P2X4亚单位，这些亚单位被外源性ATP激活。通过使用与P2X4细胞内吞基序竞争的肽增加P2X4通道的膜表达，增强SF-1 GFP阳性神经元的神经元兴奋性。这种增加的兴奋性被P2X受体拮抗剂抑制。此外，表面P2X4受体表达增加显著降低SF-1 GFP阳性神经元GABA能突触后电流的频率和幅度。协同免疫普及和下拉分析显示P2X4受体与氨基丁酸A型（GABA（A））受体复合，并证明P2X4亚基羧基尾部的两个氨基酸对其与GABA（B）受体的物理联系至关重要。这两个残基的突变阻止了物理结合，从而阻断了P2X4和GABA（A）受体之间的交叉抑制。此外，使用含有已识别基序的竞争性肽破坏物理偶联，可消除重组系统中P2X4和GABA（A）受体之间的电流抑制，并消除SF-1 GFP阳性神经元中P2X4R介导的GABA能抑制。因此，我们目前的工作为兴奋性受体和抑制性受体之间的相互作用提供了证据，这些相互作用似乎对决定中枢突触的GABA能突触强度至关重要。

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数字

图1。
图1。
使用干扰肽阻断P2X4受体内化。 一个图中显示了野生型P2X4和内化缺陷突变体P2X4FLAGIN的P2X受体拓扑结构和C末端结构域序列。适配器蛋白2结合域位于大胆的，FLAG序列为下划线的.干扰顺序(11摄氏度)和控制(3A级)还指出了肽。B类，代表性痕迹显示肽11C对ATP振幅的影响（100μ米)表达P2X4野生型卵母细胞每5分钟诱发的电流(顶部)或内化缺陷P2X4FLAGIN(底部)注射11C（150μ米,黑色箭头).右侧面板图中显示了注入后10分钟记录的ATP电流振幅(t3（第三节）)肽11C或对照肽(3A级)相对于注射后立即记录的初始ATP响应(t1时间)在P2X4或P2X4FLAGIN表达细胞中。n个介于圆括号; **,对< 0.005.C，一个使用抗P2X4抗体的代表性Western blot显示肽11C对P2X4受体表面表达的影响爪蟾生物素化后的卵母细胞。右侧面板，在肽存在下获得的P2X4总蛋白和表面蛋白的定量(11摄氏度或3A级)或在缺乏肽的情况下(C). 非-镍，注射的卵母细胞；*，对< 0.05; 2-4个独立实验。
图2。
图2。
阻断P2X4受体内化增加SF-1 GFP阳性神经元的兴奋性。 一个，免疫荧光显微镜的代表性图像显示P2X4的表达(顶部面板)和P2X2亚单位(底部面板)在SF-1 GFP阳性小鼠的VMH中(比例尺=15微米）。P2X4亚单位(红色)在VMH中高度表达，包括SF-1 GFP阳性神经元，而P2X2亚单位在VMH很少检测到。B类，表达P2X4或P2X2的细胞数量归一化为SF1 GFP阳性细胞的数量(n个对于P2X4和P2X2，分别＝100或194）。51%的SF1神经元表达P2X4亚单位。C，记录样本显示SF-1 GFP阳性神经元对加入或不加入11C（150μ米). SF-1 GFP阳性神经元对1 m米列车自动防护系统(左侧面板). HP=−70 mV。汇集的数据是ATP响应的平均振幅。11C而非对照肽的加入增加了ATP反应的平均振幅(右侧面板).D类外源性ATP的应用增加了SF-1 GFP阳性神经元的放电频率。ATP的简短应用（～10 s）（1 m米)可逆去极化并增加动作电位放电的频率米=−50毫伏。条形图代表SF-1 GFP阳性神经元放电频率和膜电位的变化(n个=5个神经元）。E类，记录样本显示11C在场时sPSC(顶部面板).底部面板，显示了扩展的时间刻度。在11C存在下检测的三分之一的神经元显示出自发的突触事件(n个=20个神经元中的7个）。左侧面板，显示了sPSC记录道的叠加。HP=−70毫伏。一层楼和地上二层，在电流钳模式下从SF-1 GFP阳性神经元记录代表性痕迹。抑制P2X4受体的膜内化增加了SF-1神经元的自发兴奋性。动作电位放电频率随时间增加而增加。V（V）米=−58毫伏。地上二层，神经元的动作电位放电如F1所示(一,b条、和c（c）)在扩展的时间尺度上。PPADS逆转了11C的影响(一层楼和地上二层).G公司和H（H），使用PPADS（50μ米)如图所示。11C去极化并增加SF-1 GFP阳性神经元的放电频率(n个=6个神经元）。
图3。
图3。
P2X4和GABA之间的交叉抑制一个细胞中的受体同时表达这两种受体。 一个，野生型P2X4和α2β3受体之间的相互串扰爪蟾显示卵母细胞。A1类，ATP+GABA诱导电流的共同应用(实际)明显小于算术和(预测)单个ATP（100μ米)和GABA（100μ米)回应(左侧面板). 相反，在ATP应用期间连续应用GABA表明电流抑制是相互作用的(右侧面板). V（V）米=−60毫伏。A2类，的条形图显示单个电池预测响应的归一化峰值电流；***，对<0.0005；**，对< 0.005; *,对< 0.05.B类，显示了在ATP和GABA（100μ米每个）。C，在几种保持电位下测量电流抑制。应用ATP、GABA或两种激动剂后，在−60或+20 mV下记录的代表性痕迹(左侧面板)如图所示。在−60至20 mV的保持电位下记录的电流抑制百分比的汇总数据(右侧面板,n个=3–7）。D类，在没有细胞外CaCl的情况下测量到类似的电流抑制2在正常振铃器（1.8 m）中应用ATP、GABA或两种激动剂诱导的代表性电流米氯化钙2)或在无钙振铃器中显示。右侧面板，存在或不存在外部CaCl时记录的电流抑制百分比的汇总数据2(n个对于每个条件＝10）。Vh（沃尔沃），保持潜力。
图4。
图4。
P2X4与GABA的关联一个大鼠下丘脑受体和在体外。 一个，用抗β3、抗α2或抗myc抗体进行的Western blot显示野生型α2β3或α2 myc标记的β3 GABA的联合免疫纯化一个卵母细胞中P2X4抗体受体同时表达这两种受体(左侧面板)以及下丘脑组织(HT（高温）) (右侧面板).左侧面板，免疫印迹显示抗myc和抗P2X4抗体。右侧面板，免疫印迹显示抗α2和抗P2X4抗体。P2X4免疫沉淀后，仅在表达α2β3受体的卵母细胞中未检测到带(左侧面板)或在没有P2X4抗体的情况下(IP（IP）−，左边和右侧面板). 图像是四个独立实验的代表。B类，所示为显示P2X4和GABA共标记的双重免疫荧光图像一个SF-1 GFP阳性神经元的β3亚单位(电子GFP).箭头显示三标记单元格的示例(比例尺=20微米）。红外，免疫反应。
图5。
图5。
P2X4亚基羧基末端的两个残基的鉴定是交叉抑制所必需的。 一个图中显示了N端和C端尾部的P2X4亚单位序列。确定的对串扰至关重要的残留物有下划线的。B类，摘要条形图表示在联合应用ATP+GABA（100μ米每个）；*，对< 0.05; 括号中显示了单元格的数量；nf、，非功能突变体。C，突变体P2X4 Y374S/V375T和GABA之间记录的加性电流的代表性痕迹一个（α2β3）受体（HP=−60 mV）表明Tyr374和Val375对P2X4和GABA之间的分子相互作用至关重要一个受体。
图6。
图6。
P2X4和GABA的物理关联一个受体和电流抑制的维持依赖于重组表达系统中P2X4C末端的特异性残基。 一个，所示为抗FLAG或抗myc抗体经抗myc免疫沉淀后的代表性Western blot(IP：我的)或抗FLAG抗体(IP：标志)表达GABA的细胞提取物一个α2β3myc、P2X4FLAGIN或P2X4FLAGINYV/ST单独或组合(A1类).酒吧表示两种受体类型的抗myc或FLAG抗体免疫沉淀后观察到的信号的相对强度(免疫共沉淀，共免疫沉淀分数）。数据来自四个独立的实验*对< 0.05 (A2类).B类，野生型P2X4亚单位和设计肽（YV6和YV6/ST）的C末端结构域序列。衔接蛋白2结合结构域位于粗体。C图中所示为用固定化多肽将表达α2β3myc受体的卵母细胞的抗myc抗体拉下后的Western blot(YV6发动机或YV6/ST型)或在缺少肽（树脂）的情况下(C1类).酒吧表明α2β3myc与YV6的相关性显著强于YV6/ST*对<0.05，三个独立实验(指挥与控制).纳秒，不显著。D类，100μ米ATP、GABA或两种激动剂(实际)在卵母细胞中共同表达P2X4FLAGIN和GABA一个α2β3受体缺失(控制)或注射YV6肽（150μ米) (第1页). YV6肽存在时电流抑制降低，但YV6/ST不降低。**，对< 0.005,n个= 5–13. V（V）米=−60毫伏(D2类).
图7。
图7。
P2X4受体表达增加改变SF-1 GFP阳性神经元的GABA能突触效能。 A–E，阻断P2X4受体内化抑制GABA能传递一个，记录显示11C（150μ米) (A1类).A2类，显示的是扩展时间刻度上的样本跟踪。HP=−70毫伏。B类在相同条件下，输注对照3A肽（150μ米)未随时间改变GABA能量传输(地下一层).B2级，显示的是扩展时间刻度上的样本跟踪。HP=−70毫伏。C，标准化IPSC频率与11C存在下的时间(n个=10）和3A(n个= 10).D类和E类图中显示了两个时间点11C或3A的sIPCS频率和振幅的变化。这些参数之间存在显著差异(对<0.05，单因素方差分析）。F类,G公司、和H（H）P2X受体拮抗剂TNP-ATP（30μ米).F类，显示了在11C存在下应用TNP-ATP前后sIPCS的记录样本。TNP-ATP逆转了11C对sIPCS的影响。G公司和H（H）,图显示了在应用TNP-ATP之前和之后神经元的sIPSC频率和幅度的归一化变化。HP=−70毫伏。
图8。
图8。
P2X4与GABA的分子相互作用一个受体调节GABA能突触传递。 一个，所示为贴片吸管中同时存在11C和YV6时GABA能sIPCS的样本记录(上部面板). 这个底部面板是在扩展的时间尺度上。HP=−70 mV。SF-1 GFP阳性神经元的sIPCS频率和振幅没有变化。B类11C和YV6/ST 11C的存在显示了GABA能sIPCS的样本痕迹。11C抑制GABA能传递到SF-1 GFP阳性神经元(上部面板). 这个底部面板在扩展的时间尺度上。HP=−70毫伏。C，频率与YV6存在11C的时间（150μ米)或YV6/ST（150μ米)结果显示，YV6可消除11C诱导的IPSC抑制，但YV6/ST不能消除。D类，11个频率的汇总数据(11摄氏度+YV6发动机)和7(11摄氏度+YV6/ST型)显示神经元。对<0.05，单因素方差分析检验。
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