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.2011年1月20日；117(3):1071-80.
doi:10.1182/bloud-2010-01-264507。 Epub 2010年11月3日。

内皮血管性血友病因子调节血管生成

理查德·德斯塔克 1, 弗朗西斯科·费拉罗, Koralia E Paschalaki公司, 尼古拉·H·德莱顿, 托马斯·A·J·麦金农, 瑞秋·E·萨顿, 埃尔斯佩思·M·佩恩, 多里安·哈斯卡德, 阿伦·德·休斯, 丹尼尔·卡特勒, 迈克·A·拉凡, 安娜·M·兰迪
附属公司

内皮血管性血友病因子调节血管生成

理查德·德斯塔克等。 血液. .

摘要

血管形成的调节对许多生理过程至关重要，血管生成是治疗从缺血到癌症等疾病的新方法的主要领域。病理性血管生成的临床表现是血管发育不良，这是一种引起严重胃肠道出血的血管畸形。血管发育不良可能与von Willebrand病（VWD）有关，这是人类最常见的出血性疾病。VWD是由von Willebrand因子（VWF）缺陷或缺乏引起的，VWF是一种参与炎症的正常止血所必需的糖蛋白。我们假设VWF调节血管生成。内皮细胞（ECs）中短干扰RNA（siRNA）对VWF表达的抑制导致体外血管生成增加，血管内皮生长因子（VEGF）受体-2（VEGFR-2）依赖性增殖和迁移增加，同时整合素αvβ3水平降低，血管生成素（Ang）-2释放增加。从VWD患者的血源性内皮祖细胞扩增的内皮细胞证实了这些结果。最后，两种不同的方法（原位和体内）显示，VWF缺乏小鼠的血管生成增加。因此，我们确定了VWF在内皮细胞中的一种新功能，这证实了VWF是一种具有多种血管作用的蛋白质，并定义了止血和血管生成之间的新联系。这些结果可能对VWD的管理产生重要影响，对血管疾病具有潜在的治疗意义。

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图1
图1
VWF缺陷细胞在体外显示血管生成增强.VWF-特异性（20nM；siVWF，封闭条）或对照siRNA（20nM；siCTL，开放条）转染到HUVEC中24或48小时。通过（A）RT-PCR、（B）Western blotting（显示代表性印迹）或（C）VWF ELISA检测这些细胞中VWF的表达。（D） 用对照或VWF-特异性siRNA处理24小时的HUVEC接种到Matrigel上。24小时后，在存在（右面板）或不存在（左面板）10μg/mL VWF的情况下观察到毛细血管网络的形成，并通过测量总管道长度（以微米为单位）在面板E中进行量化。（巴=200μm）。面板A和C中的siVWF数据已归一化为siCTL。siCTL，非特异性siRNA处理的细胞；siVWF、VWF siRNA-处理细胞；UT，未处理细胞（n=3）。误差线=平均值±SEM*P（P）< .05; **P（P）< .01; ***P（P）<.001（学生t吨测试）。
图2
图2
由于VEGFR-2信号的增加，VWF-缺陷细胞在体外的迁移和增殖增加（A）siCTL或siVWF治疗的HUVEC迁移到受伤区域16小时的典型轨迹图，从siRNA治疗后30小时开始。每个细胞轨迹的起点绘制在图形的中心，受伤区域位于x轴零的左侧。（B） 含或不含50 ng/mL VEGF或含4μM VEGFR-2抑制剂SU4312的迁移速度（单位：微米/分钟）。（C） 细胞迁移的方向性（欧氏距离/累积距离）。（D） 对照组或siVWF治疗24小时后，HUVEC增殖（单位：细胞/平方厘米），加或不加100 ng/mL VEGF培养96小时。面板D中的siVWF数据已归一化为siCTL-VEGF。siRNA治疗后120小时，siVWF仍然有效（数据未显示）。siCTL，非特异性siRNA处理细胞；siVWF、VWF siRNA-处理细胞（n=3）。误差线=平均值±SEM*P（P）< .05; **P（P）<.01（学生t吨测试）。
图3
图3
VWF缺乏的细胞表现为β3整合素表达减少，αvβ3依赖性粘附，β3整合素内化率增加，Ang-2释放增加用RT-PCR测定（A）β3 mRNA的表达。（B） 通过Western blotting测定β3整合素总蛋白表达（显示代表性印迹），并通过密度测定法相对于微管蛋白进行定量。（C） 在siRNA处理后24和48小时，用流式细胞术测定总αvβ3（抗体：LM609）的表面水平。（D） 转染48小时后，将对照或siVWF处理的细胞接种到不同的细胞外基质基质上。40分钟后，通过温和清洗去除非粘附细胞，结合细胞数量相对于播种总数进行量化。（E） 37°C孵育7.5分钟后，β3整合素从细胞表面内化。（F） 转染后48小时通过ELISA测量对照或siVWF处理的细胞的上清液中Ang-2的水平。将数据（A-C，F）归一化，以控制每个时间点的siRNA处理细胞。开口钢筋，siCTL；封闭杆，siVWF。误差线表示平均值±SEM（n=3）*P（P）< .05; **P（P）<.01（学生t吨测试）。
图4
图4
VWF缺乏小鼠显示血管生成增加和成熟血管密度增加（A）将Matrigel皮下注射到窝友对照组（CTL；顶部面板）或VWF-缺陷小鼠（KO；底部面板）。对7天龄的耳塞进行切除、切片，并用苏木精和伊红染色（左侧面板），或用抗CD31（中间面板）或VEGFR-2（右侧面板）进行免疫荧光显微镜检查。尺寸棒=20μm。（B） 在CTL（开放酒吧）或KO（封闭酒吧）的苏木精和伊红切片中定量细胞浸润。n=5只KO小鼠和n=6只CTL小鼠。（C） 扑杀CTL或KO小鼠并切除整只耳朵。耳朵用抗α-SMA-Cy3染色，并进行瓷砖扫描以获得整个耳朵的合成图像（左面板）。尺寸栏=2 mm。血管被识别、分割并转换为二值图像（右面板）。计算耳朵总面积、血管面积（相对于耳朵总面积）和分形维数。n=5只KO小鼠和n=7只CTL小鼠，误差条表示平均值±SEM**P（P）<.01（学生t吨测试）。
图5
图5
VWD患者的BOEC显示体外血管生成、增殖和迁移增加（A）健康对照组（左上角）和VWD患者（左下角）的BOEC代表性图像。培养7-22天后出现菌落（尺寸栏=200μm）。对BOEC进行VE-cadherin、ICAM-2和CD45染色。细胞核用TO-PRO3（Invitrogen）染色。尺寸棒=20μm。（B） 48小时后从培养的BOEC中分泌VWF（μg/mL）。（C） 将BOEC接种在Matrigel上24小时，并通过测量总管长（单位：微米）来量化毛细管网络的形成。尺寸棒=200μm。（D） 与未刺激对照组相比，用100 ng/mL VEGF培养96小时的BOEC增殖。（E） 首次传代前内皮细胞集落边缘细胞的迁移速度。每个患者都用一个独特的符号进行标识（有关VWD患者的代码和信息，请参阅补充表1）。误差线表示平均值±SEM*P（P）< .05; **P（P）<.01（学生t吨测试）。
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参考文献

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