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.2010年5月；31(5):585-92.
doi:10.1038/aps.2010.29。 Epub 2010年4月26日。

WSS45是一种硫酸化α-D-葡聚糖，在体外强烈干扰登革2型病毒感染

仙坤通 1, 洪秋, 张欣（Xin Zhang）, 李平石, 王桂凤, 飞鸿记, 惠阳鼎, 魏棠, 坎丁, 左建平
附属公司

WSS45是一种硫酸化α-D-葡聚糖，在体外强烈干扰登革2型病毒感染

仙坤通等。 中国药理学报. 2010年5月.

摘要

目标：研究WSS45（天麻中α-D-葡聚糖的一种硫酸化衍生物）对登革热病毒血清型2（DV2）增殖周期的作用模式，包括初始感染和细胞内复制。

方法：通过qRT-PCR、斑块减少试验和流式细胞术监测BHK细胞中的病毒增殖。通过转换温度和用酸性甘氨酸处理，将最初的病毒感染分解为吸附和渗透步骤。Evelope蛋白免疫荧光染色检测表面结合病毒。

结果：WSS45在病毒周期的早期阶段有效抑制了BHK细胞中DV2的感染，EC（50）值为0.68+/-0.17微克/毫升，主要干扰病毒的吸附。然而，WSS45没有显示出杀病毒作用。此外，WSS45可以增加病毒从BHK细胞表面的分离。

结论：WSS45通过干扰病毒与靶细胞之间的相互作用，对DV2产生了强大的抑制作用。这种活性与分子大小有关。

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数字

图1
图1
WSS45的结构。
图2
图2
用于调查病毒感染过程的方法示意图。（A） 病毒与细胞在37°C的温度下在有或无化合物的情况下孵育2小时。然后清洗细胞以去除化合物和病毒。24小时后通过斑块形成试验或流式细胞仪测定病毒感染水平。（B） 病毒吸附试验。细胞在4°C下与病毒孵育，以便在有或无化合物的情况下吸附病毒，然后清洗。24小时后用流式细胞仪检测病毒感染水平。（C） 病毒渗透试验。将病毒添加到细胞中，并让其在4°C下吸附到细胞上1小时。清洗培养物，然后在37°C下与不同浓度的化合物孵育2 h。用酸性甘氨酸缓冲液（pH 3.0）灭活细胞外病毒。用流式细胞术在24小时检测病毒感染。（D） 吸附后分析。在病毒吸附过程中使用了类似的实验程序，并清洗掉了过量的病毒。然后将细胞与化合物在4°C下暂时孵育30分钟，然后再次清洗。通过流式细胞术和qRT-PCR测定病毒感染水平。
图3
图3
WSS45的抗-DV2活性。（A） WSS45的细胞毒性作用。将细胞暴露于化合物中48 h，并用MTT法评估细胞毒性。这表明WSS45在3 mg/mL时对细胞存活率有轻微影响。（B）WSS45对BHK细胞的抗病毒活性。将DV2（MOI=0.1）病毒添加到所示化合物存在的汇合细胞中。在感染后48小时提取上清液病毒RNA并通过qRT-PCR进行定量。WSS45以剂量依赖的方式显著降低上清液病毒产量。结果用三个独立实验的平均值±标准差表示。b条P（P）<0.05与对照组。
图4
图4
WSS45在病毒感染宿主细胞期间发挥其活性。（A） 病毒阻断和细胞受体阻断试验。病毒阻断试验：病毒（1×106用化合物预处理的PFU/mL）感染BHK细胞。流式细胞术检测病毒感染水平。使用E蛋白特异性中和抗体（克隆3H5）作为阳性对照。与对照组相比，阻断活性的百分比显示为感染细胞的减少。细胞阻断试验：用化合物预处理的细胞感染DV2（MOI=1）。感染2h后，用酸性甘氨酸缓冲液处理细胞，灭活细胞外病毒，培养24h，用流式细胞仪检测病毒感染水平。两个实验均表明，WSS45对病毒阻断或细胞受体阻断无影响，而针对病毒E蛋白的中和抗体表现出病毒阻断活性。结果显示，与对照组相比，感染细胞的百分比发生了变化。显示了两个实验的平均值±SD。（B） WSS45对病毒初始感染的抑制作用。WSS45在感染期间通过与病毒（100 PFU）一起添加来评估抗病毒感染性，或在感染后2小时添加并在2小时后冲走来评估感染后的抗病毒感染能力。进行菌斑减少试验以确定WSS45的抑制作用。与用培养基代替化合物的对照组相比，结果显示为斑块形成的百分比。结果表明，WSS45在病毒初始感染期间添加时，可显著抑制病毒感染。结果表示为三个独立实验的平均值±SD。
图5
图5
WSS45强烈抑制BHK细胞对病毒的吸附。通过温度和酸性甘氨酸缓冲液处理，将最初的病毒感染分解为吸附和渗透步骤，如图1所示。病毒NS1蛋白染色后用流式细胞仪检测感染性水平。结果表明，WSS45主要抑制病毒吸附，而对病毒渗透的抑制作用较弱。病毒穿透后WSS45处理对病毒细胞内复制无影响。这里给出的结果代表了三个单独的实验。
图6
图6
WSS45的吸附后处理抑制了DV2感染。（A） WSS45对BHK细胞病毒感染的吸附后作用。该程序如图1D所示。细胞与病毒（MOI=1）在4°C下孵育以吸附病毒。清洗去除病毒后，用WSS45在4°C下培养细胞30分钟，然后清洗。通过流式细胞术测定感染的细胞。与用新鲜培养基培养的对照组相比，感染细胞的比率显示出抑制作用。吸附后添加WSS45以剂量依赖的方式抑制病毒感染。抑制活性与抗吸附活性成正比。（B） 显示了三个独立实验的结果（平均值±SD）。b条P（P）<0.05与中等浓度对照组。
图7
图7
WSS45诱导病毒从BHK细胞表面脱落。（A） 后吸附期WSS45对BHK细胞中病毒RNA吸附的影响。病毒吸附后，用WSS45处理细胞30分钟，如图1D所示。立即提取细胞RNA，用qRT-PCR方法定量，并归一化为细胞GAPDH RNA水平。这表明，病毒吸附后与WSS45孵育可以降低吸附的病毒RNA水平，这意味着粘附在细胞膜上的病毒离子减少。结果表示为三个独立实验的平均值±SD。b条P（P）<0.05与对照组。（B） WSS45吸附后处理对与BHK细胞结合的病毒粒子的影响。BHK细胞生长在盖玻片上，并按照吸附后实验所述进行处理。在用WSS45和肝素进行吸附后培养后，用PFA清洗和固定细胞，并对病毒E蛋白进行免疫荧光染色。照片是用荧光显微镜拍摄的。WSS45在病毒吸附后孵育导致荧光斑点的损失。这一结果与吸附病毒的RNA水平一致。这里给出的结果代表了三个单独的实验。
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