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。2010年5月；30(10):2563-77.
doi:10.1128/MCB.01075-09。 Epub 2010年2月22日。

果蝇RB蛋白通过两种不同机制抑制分化特异性基因

汉诺·李 1, Katsuhito Ohno大野, 叶卡捷琳娜·沃斯科波尼克, 琳达·拉古萨诺, 安娜·马丁内斯, Dessislava K Dimova公司
附属机构

果蝇RB蛋白通过两种不同的机制抑制分化特异性基因

汉诺·李等。 分子细胞生物学。 2010年5月。

摘要

RB和E2F蛋白通过控制参与这些过程的基因的表达，在细胞分裂、细胞死亡和发育的调节中发挥重要作用。视网膜母细胞瘤蛋白（pRB）对细胞周期调控启动子的抑制机制已被广泛研究。然而，关于发育调控E2F/RB基因的研究还很少。在这里，我们利用了苍蝇中E2F/RB通路的简单性来检查分化特异性靶基因的调控。这些基因被dE2F2/RBF和最近发现的含RB复合物dREAM/MMB以与细胞类型和细胞周期无关的方式抑制。我们的研究表明，阻遏机制不同于细胞周期调节基因的机制。我们发现两种不同的活动参与了它们的调节，而在增殖细胞中，两者都是维持抑制所必需的。首先，dE2F2/RBF和dREAM/MMB在启动子区域利用组蛋白去乙酰化酶（HDAC）活性。值得注意的是，我们还发现了zeste的Polycomb群（PcG）蛋白增强子[E（Z）]的非常规阻遏机制，该增强子通过转录起始位点（TSS）下游核小体上组蛋白H3 Lys27的二甲基化参与这些基因的沉默。

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数字

图1。
图1。
缺乏dREAM/MMB组分的细胞中D/E组基因启动子组蛋白乙酰化水平的变化。（A） 用靶向dE2F2、p55CAF1或白色（对照）的双链RNA（dsRNA）培养SL2细胞的全细胞提取物进行Western blot分析。β-管蛋白作为负荷控制。（B） Northern blot分析从与靶向Mip40、Mip120或白色的dsRNA孵育的细胞中提取的总RNA。（C和D）ChIP分析使用识别与靶向白色（对照）、dE2F2、p55CAF1、Mip40或Mip120的dsRNA孵育的细胞中的泛酸化组蛋白H3（左面板）或泛酸化组织蛋白H4（右面板）的抗体进行。通过实时定量PCR测定共沉淀DNA的数量。结果被归一化为非特异性序列（启动子RP49型)并表示三个独立实验结果的平均值。的启动子区域CG7628型（非E2F-调节基因）和围绕调控区的序列类沥青基因（bxdPRE）作为阴性对照。
图2。
图2。
dRPD3缺失对D/E组基因启动子组蛋白乙酰化的影响。（A） 用靶向dRPD3或Mip40和Mip120的双链RNA（dsRNA）孵育SL2细胞的全细胞提取物进行Western blot分析。（B） 用靶向白细胞（对照）、dRPD3、Mip40和Mip120（共处理）或Mip40、Mip120和dRPD4（共治疗）的dsRNA孵育的细胞中的泛酸化组蛋白H3（左面板）或组蛋白H4（右面板）抗体进行ChIP分析。将结果归一化为RP49型启动子序列。
图3。
图3。
HDAC活性的抑制影响乙酰化水平和D/E组基因的抑制。（A） 对用PBS（对照）或丁酸钠（NaB）处理16 h的细胞全细胞提取物进行Western blot分析。用识别乙酰化组蛋白H3和β-微管蛋白的抗体对blot进行检测。（B） 在PBS（对照）或丁酸钠（NaB）处理的细胞中，用识别泛酸化组蛋白H3（左面板）或泛酸化组织蛋白H4（右面板）的抗体进行ChIP分析。（C） 使用探针进行Northern杂交分析引发酶(DNA管道; 细胞周期调节E2F靶基因）和多组D/E基因，阿普53D,CG3505型,CG17142号、和CG8399型。请注意CG3505型和CG17142号生成两份不同大小的抄本。从与靶向dRPD3的双链RNA（dsRNA）或与NaB或对照（白色dsRNA，PBS）孵育的细胞中提取总RNA。
图4。
图4。
dRPD3在Arp53D启动子区的结合。（A） 用抗RPD3或非特异性抗体（Ab）进行ChIP分析。分析共沉淀DNA的启动子序列是否存在DNA聚合酶α（DNApolα），RP49型，或的两个区域阿普53D启动子（远端和近端区域由假定E2F结合位点的存在决定，并描述为面板D）。（B） 三个独立实验的ChIP结果通过定量实时PCR测定。（C） dRPD3结合依赖于dE2F2。用白色（对照）或dE2F2缺失细胞中的抗RPD3抗体进行ChIP分析。ds，双绞线。（D） 的结构阿普53D启动子区域。D、 远端；P、 近端区域；TSS，转录起始位点。这些数字描述了与TSS的距离。
图5。
图5。
D/E组基因启动子的组蛋白甲基化。用抗H3K9me3（A）、抗H3K9me2（B）、抗-H3K27me2（C）、抗H-4K20me3（D）、抗-H4K20me（E）、抗-H4K20me1（F）、抗-H3K9me3（G）和抗-H3K9me2（H）或非特异性抗体进行ChIP检测。免疫沉淀DNA通过定量实时PCR定量。将结果归一化为RP49型序列和表示三个独立实验结果的平均值。的启动子序列旋转5（H3K9me3）（G）或CG11165型（H3K9me2）（H）作为检测的阳性对照。抗体。
图6。
图6。
D/E组基因编码区的组蛋白H3K27me2。（A） 使用抗H3K27me2抗体进行ChIP分析。扩增了代表D/E组基因TSS下游约200至约300 bp区域的序列。结果被量化并标准化为RP49型启动子序列。（B） 按照A组所述进行ChIP分析，但使用抗H3K27me3抗体。缺乏扩增表明，在实验中获得的结果（结果显示在面板A中）是特定的，而不是由于抗体交叉反应。围绕的调控区序列类沥青（bxdPRE）作为H3K27me3的阳性对照。抗体。
图7。
图7。
去除dE2F2/RBFs或dREAM/MMB可降低D/E组基因的组蛋白H3K27me2水平。（A） 用靶向RBF1、RBF2或RBF1和RBF2（共处理）的双链RNA孵育SL2细胞的全细胞提取物的Western blot分析。用抗RBF1、抗RBF2和抗β-微管蛋白抗体检测斑点。（B） 用荧光素酶RNAi（Luc；对照）、RBF1、RBF2、RBF1和RBF2或dE2F2耗尽的细胞中的抗H3K27me2抗体进行ChIP分析。（C） 在缺乏荧光素酶（对照）或Mip40和Mip120的细胞中使用抗H3K27me2抗体进行ChIP分析。将结果归一化为RP49型启动子序列，并表示三个独立实验结果的平均值。
图8。
图8。
E（Z）是抑制D/E组基因所必需的。（A） 用靶向白色（对照）或E（Z）的双链RNA（dsRNA）处理细胞，并用抗E（Z）或抗β-微管蛋白抗体探测细胞的全细胞提取物的Western blot分析。（B） 用靶向白色（对照）或G9a的dsRNA处理细胞后分离的总RNA的Northern blot分析G9a公司和β-微管蛋白（C）在缺乏荧光素酶（Luc；对照）、E（z）或G9a的细胞中使用抗组蛋白H3K27me2抗体进行ChIP分析。（D） E（Z）需要维持D/E组基因的抑制。Northern blot分析使用多组D/E基因探针和β微管蛋白（装载控制）。从用dsRNA处理过的白细胞（对照）、dE2F2和E（z）细胞中分离出总RNA。（E） 缺乏dREAM/MMB成分的细胞中E（Z）蛋白水平不受影响。用靶向荧光素酶（对照）、dE2F2、RBF1、RBF2、RBS1和RBF2（共处理）或Mip40和Mip120（共处理的）的dsRNA处理的细胞的全细胞提取物进行Western blot分析。用抗E（Z）和抗β-微管蛋白（负荷控制）抗体检测斑点。（F） E（Z）与RBF1和RBF2共同免疫沉淀。抗RBF1或抗RBF2抗体与表达Flag-HA标记E（Z）的细胞提取物一起用于免疫沉淀。在免疫沉淀之前，将提取物与200μg/ml溴化乙锭（+）或不含EtBr（−）孵育。分析免疫复合物是否存在共沉淀HA-E（Z）；其中一部分用抗RBF抗体进行印迹。WCE，全细胞提取物（加载输入的1/200）；β-微管蛋白，非特异性抗体对照。
图9：。
图9：。
dREAM/MMB通过两种独立的机制抑制D/E组基因。（A） 用靶向白色（对照）或Pc的双链RNA（dsRNA）处理的细胞的全细胞提取物的Western blot分析。用抗Pc或抗β-微管蛋白抗体探测blot。（B） 使用探针对D/E基因组或β-微管蛋白。从白色、p55CAF1-或Pc-缺失细胞中分离出总RNA。（C） dE2F2或E（Z）缺失细胞中D/E组基因编码区H3K27乙酰化水平的变化。使用靶向白色（对照）、dE2F2或E（Z）的dsRNA处理的SL2细胞中的抗乙酰基H3K27抗体进行ChIP分析。（D） D/E组基因编码区的组蛋白H3K27me2不受HDAC抑制的影响。用PBS或NaB处理的细胞上的H3K27me2抗体进行ChIP检测。（E） D/E组基因启动子区的组蛋白乙酰化不受E（Z）缺失的影响。用全乙酰化组蛋白H3（上图）或全乙酰化组蛋白H4（下图）抗体进行ChIP测定。注意，本实验中使用的泛乙酰化组蛋白H3抗体并不针对H3K27位点。（针对组蛋白H3的前20个氨基酸组成的肽提出抗体）。（F） 使用探针对D/E组基因进行Northern blot分析。总RNA是从用dsRNA靶向白色（对照）、dE2F2、E（Z）、dRPD3或两者（顶面板）培养的细胞中分离出来的，或用E（Z）dsRNA或NaB处理的细胞，或用E（Z）dsRNA和NaB共同处理的细胞（底面板）。
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