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。2010年1月1日；70(1):378-87.
doi:10.1158/0008-5472.CAN-09-2021。 Epub 2009年12月8日。

MicroRNA-145通过直接靶向粘蛋白1抑制细胞侵袭和转移

莫希特·萨赫德瓦 1, 尹元墨
附属公司

MicroRNA-145通过直接靶向黏蛋白1抑制细胞侵袭和转移

莫希特·萨赫德瓦等。 癌症研究。 。

摘要

微RNA是重要的基因调节因子，在肿瘤发生中起着重要作用。我们之前的研究表明，miR-145是一种能够在体内外抑制肿瘤细胞生长的肿瘤抑制剂。在本研究中，我们发现miR-145以细胞特异性的方式发挥其功能。虽然miR-145抑制MCF-7和HCT-116细胞的细胞生长，但对转移性乳腺癌细胞系的细胞生长没有显著影响。然而，miR-145显著抑制这些细胞的细胞侵袭；相反，针对miR-145的反义寡核苷酸增加了细胞侵袭。在实验性转移动物模型中，miR-145也能够抑制肺转移。这种miR-145介导的细胞侵袭抑制在一定程度上是由于转移基因粘蛋白1（MUC1）的沉默。利用携带MUC1 3’-非翻译区的荧光素酶报告子结合Western blot和免疫荧光染色，我们确定MUC1为miR-145的直接靶点。此外，MUC1的异位表达增强了细胞侵袭，miR-145可以阻断这种侵袭。有趣的是，miR-145对MUC1的抑制导致β-catenin和致癌钙粘蛋白11的减少。最后，RNAi对MUC1的抑制模拟了miR-145抑制侵袭的作用，这与β-catenin和钙粘蛋白11的下调有关。综上所述，这些结果表明，miR-145作为一种肿瘤抑制剂，不仅抑制肿瘤生长，还抑制细胞侵袭和转移。

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数字

图1
图1。的影响miR-145型细胞侵袭与肺转移
A类&B类，稳定转导的MDA-MB-231或LM2-4142细胞体外表达miR-145型（145）或单独载体（V）进行基质凝胶室试验，详见材料和方法。膜上侵入的细胞计数如下。由于细胞在膜上的分布并不总是均匀的，我们首先在低倍镜下拍照，然后在计算机屏幕上用网格放大图像，以便对整个膜上的所有细胞进行计数。B类&D类实验性转移动物模型显示肺转移。稳定转导MDA-MB-231(B类)或LM2-4142(D类)体外表达的细胞miR-145型如材料和方法所述，通过尾静脉将（145）或单独载体（V）导入雌性裸鼠体内。值A类和C类是三个独立实验的平均值±SE。**，p＜0.01；SC，加扰寡头；反145，反-miR-145型。
图2
图2。miR-145型直接瞄准MUC1
A、，的影响miR-145MUC1-3'-UTR荧光素酶报告。顶板：MUC1 3'-UTR和miR-145型还有一个变种人miR-145型或突变MUC1-3’-UTR，其中红色序列被删除或突变。底部面板：携带MUC1的3'-UTR（Luc-MUC1-UTR）的荧光素酶报告子，删除miR-145型3'-UTR（Luc-MUC1-UTR-d）或突变体的结合位点miR-145型结合位点发生突变（Luc-MUC1-UTR-mt），与miR-145型（145）中，miR-206型(206),miR-224型（224），突变miR-145型（145-mt）或载体对照（V），24小时后采集细胞进行荧光素酶分析。miR-206型和miR-224型用作阴性对照。B、，miR-145型抑制，而反-miR-145型增强MUC1的内源性蛋白水平。稳定转导的体外表达MDA-MB-231细胞miR-145型或瞬时转染抗-miR-145型western blot分析。顶部面板：效果miR-145型或反-miR-145型MUC1的大（L）和小（S）亚型。底部面板：稳定转导的MDA-MB-231细胞miR-224基因未显示MUC1抑制。拓扑异构酶I（topo I）和β-肌动蛋白作为负荷控制。C类，免疫荧光染色进一步证实MUC1被抑制miR-145型在稳定转导的MDA-MB-231细胞中。细胞在盖玻片上生长过夜，然后用抗MUC1抗体进行免疫染色，如材料和方法中所述。所有带有红色信号（MUC1）的图像均在同一固定时间拍摄。合并的图片是MUC1红色信号和Hoechst染料（蓝色）核染色的叠加。中的值A类是三个独立实验的平均值±SE。**，p<0.01；SC，炒低聚糖；抗145，抗-miR-145型。
图3
图3。外源性表达的MUC1促进细胞侵袭，可通过以下途径逆转miR-145型
A类左面板：将携带Myc-tagged MUC1的表达载体（含或不含3'-UTR）导入293T细胞，转染24小时后进行western blot。用Myc标记抗体检测膜。右侧面板：miR-145型用相应的3'-UTR抑制MUC1。293T细胞转染UTR（MUC1+UTR）或无UTR（MUC1-no-UTR）以及单独载体或miR-145转染24小时后收集细胞提取蛋白质。B类，顶部面板：效果miR-145型形态变化。左三张图片：载体pCDH稳定转导MDA-MB-231细胞，miR-145型（145）或miR-380型(380). 我们使用miR-380型作为阴性对照miR-224基因因为我们的单独研究表明miR-224型能够通过靶向其他转移基因来抑制侵袭（Zhu等人未发表）。右两张图片：MDA-MB-231细胞感染MUC1以及载体控制（V）或miR-145型(145). 在侵入分析之前拍摄图像。底部面板：侵入分析后膜上侵入细胞的代表区域。C类，入侵检测的定量分析。D类.通过以下途径抑制MUC1介导的转移miR-145型在实验转移分析中。体外表达MUC1和载体（MUC1+V）或MUC1和miR-145型（MUC1+145）通过尾静脉注射到雌性裸鼠体内，详见材料和方法。中的值C类是三个独立实验的平均值±SE。**，p<0.01；*，p<0.05。
图4
图4。的影响miR-145β-catenin和钙粘蛋白11
A类和B、，miR-145型抑制，同时反-miR-145型增强β-catenin、cyclin D1和cadherin 11。稳定转导的MDA-MB-231细胞体外单独表达载体（V）或miR-145型(145); 和MDA-MB-231细胞转染打乱olig（SC）或抗-miR-145型western blot分析。C类，通过抑制钙粘蛋白11miR-145型免疫组织化学检测MDA-MB-231细胞。稳定转导的MDA-MB-231细胞体外表达载体单独或miR-145型用于免疫组织化学分析，详见材料和方法。
图5
图5。RNAi抑制MUC1可降低β-catenin、cyclin D1和cadherin 11水平以及侵袭性
A、，MUC1 siRNA对MUC1蛋白以及β-连环蛋白、钙粘蛋白11和细胞周期蛋白D1的影响。B、，MUC1 siRNA抑制细胞侵袭。用MUC1 siRNA转染MDA-MB-231细胞，然后进行侵袭试验，详见材料和方法。数值为三个单独实验的平均值±SE。**，p<0.01。
图6
图6。MUC1在乳腺肿瘤组织中的表达
A类和B类Western blot显示，与匹配的正常乳腺组织（N）相比，乳腺肿瘤（T）中MUC1上调。C类，MUC1与miR-145型乳腺肿瘤标本与正常组织正常化后。D类、免疫组化法检测MUC1在不同转移状态乳腺癌组织中的表达，答：浸润性导管癌无转移，以及b：浸润性导管癌伴转移。
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