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.2009年9月；83(17):8409-17.
doi:10.1128/JVI.00796-09。 Epub 2009年6月10日。

宿主细胞检测辅助依赖性腺病毒载体中包含的非编码填充物DNA导致转基因表达的表观遗传学抑制

P乔尔·罗斯 1, 迈克尔·肯尼迪, 罗宾·帕克斯
附属公司

宿主细胞检测辅助依赖性腺病毒载体中包含的非编码填充器DNA导致转基因表达的表观遗传抑制

P乔尔·罗斯等。 J维罗尔. 2009年9月.

摘要

辅助依赖性腺病毒（hdAd）载体在基因治疗应用中作为治疗性基因传递载体显示出巨大的前景。然而，hdAd的基因表达水平和持续时间可能会因载体中包含的非编码填充器DNA的性质而有很大差异。例如，含有22 kb原核DNA的hdAd（hdAd-prok）表达转基因的效率比含有真核DNA的类似载体（hdAd-euk）低60倍。在这里，我们确定了这种现象的机械基础。尽管这两种载体均未受到CpG甲基化的影响，且两种基因组与细胞组蛋白的关联程度相似，但hdAd-prok染色质被主动去乙酰化。在转基因和细菌脱氧核糖核酸脱压hdAd-prok之间插入绝缘体元件，表明外源脱氧核糖核酸形成扩散到转基因的抑制性染色质结构。我们发现，Sp100B/Sp100HMG和Daxx在抑制hdAd转基因表达中发挥作用，并且独立于PML小体发挥作用。因此，我们确定了与识别外源DNA有关的核因子，并确定了相关基因被抑制的机制。

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图1。
图1。
hdAd-prok表达其转基因的效率低于hdAd-euk。（A） 本研究中使用的hdAd矢量的示意图。所有载体编码Ad血清型5反向末端重复序列（ITR）和包装信号（ψ）、小鼠巨细胞病毒即刻早期启动子和增强子（CMV）、紫胶Z打开阅读框，猿猴病毒40多聚腺苷化信号（未显示）。hdAd-prok和hdAd-prom-ins编码22kb的原核DNA（prok），而hdAd-euk和hdAd-eux-ins编码22 kb的真核DNA（euk）。hdAd-prok-ins和hdAd-euk-ins各自具有插入在表达盒和填充物DNA之间的HS4双核绝缘体元件（ins）。hdAd-prok2（未显示）在结构上与hdAd-pro类似，但包含一个衍生自大肠杆菌基因组DNA。hdAd-euk2与HDΔ28E4LacZ（27）相同。（B） HeLa细胞感染hdAd-prok或-euk（MOI，1IU/cell）。在感染后3、6或24小时，制备细胞裂解物并测定β-Gal活性（平均值±标准误差；n个= 4). （C） 用hdAd-prok或-euk（MOI，0.1 IU/cell）感染HeLa细胞，24小时后用X-Gal染色。（D） 在不同的MOI下用hdAd-prok2或-euk2感染HeLa细胞，24小时后，检测细胞裂解物的β-Gal活性。误差条表示从两个重复样本中获得的值的范围。给出了三个独立实验的代表性数据。
图2。
图2。
与hdAd-euk相比，hdAd-prok与转录活性染色质标记物的相关性降低。用hdAd-prok（p）或hdAd-euk（e）（MOI，10IU/cell）感染HeLa细胞，感染后24小时，用指示的抗体处理细胞以检测ChIP。使用载体特异性（mCMV启动子和紫胶Z开放阅读框）或宿主特异性（β-肌动蛋白、β-干扰素[IFN-β]和Myt1）引物。PCR产物在琼脂糖凝胶上进行解析，并通过溴化乙锭染色进行可视化。（A） 使用针对异染色质相关组蛋白修饰的抗体进行ChIP。在HeLa细胞中，Myt1组成性不活跃（阳性对照），而β-肌动蛋白组成性活跃（阴性对照）。α、 反；2meK9H3，组蛋白H3在K9处二甲基化；3meK27H3，组蛋白H3在K27处三甲基化。（B） 使用针对转录活性染色质标记的抗体进行ChIP。在HeLa细胞中，β-肌动蛋白具有组成性活性（阳性对照），而干扰素-β在未刺激细胞中没有活性（阴性对照）。乙酰化Ac；RNApII，RNA聚合酶II。
图3。
图3。
抑制组蛋白脱乙酰化或染色质修饰从填充物DNA扩散到转基因消除了原核DNA的抑制作用。（A） 用TSA预处理HeLa细胞5h，然后用hdAd-prok或-euk（MOI，1IU/cell）感染。在感染后18小时，收集细胞裂解物并测定β-Gal活性（平均值±标准误差；n个=3）。（B） HeLa细胞未经处理或用250 ng/ml TSA预处理5 h；随后，他们感染了hdAd-prok（p）或-euk（e）或含有HS4绝缘体元件的类似载体。感染后18小时，收集细胞裂解物并测定β-Gal活性（平均值±标准误差；n个= 3).
图4。
图4。
hdAd-prok DNA未甲基化。（A） 用MspI（M）或HpaII（H）消化hdAd-prok质粒DNA或纯化的hdAd-prok病毒的DNA。消化后的DNA在琼脂糖凝胶上溶解，并通过溴化乙锭染色进行可视化。（B） 用hdAd-prok（MOI，250IU/cell）感染A549细胞，并在感染后指定天数（dpi）采集基因组DNA。基因组DNA要么未消化（−），要么用McrB/C（B）、MspI（M）或HpaII（H）消化。（C） 用hdAd-prok感染A549细胞。在感染后24小时采集基因组DNA，并用指示的酶消化带有或不带有GTP。用DIG-标记的hdAd-prok质粒DNA进行Southern印迹分析消化后的DNA。
图5：。
图5：。
PML和PML机构对于抑制hdAd-prok是不必要的。用携带靶向PML mRNA序列的shRNA质粒（shPML）或携带对照shRNA的质粒（shCtrl）转染HeLa细胞，并分析敲除效率和对hdAd基因表达的影响。（A） shRNA输送48小时后，用表达dsRed或dsRed-PML的质粒转染细胞。一天后，用光场显微镜或荧光显微镜观察细胞。（B） shRNA导入48小时后，细胞感染hdAd-prok或-euk（MOI，1IU/cell）；24小时后，收集细胞裂解物并分析β-Gal活性（重复样品的平均值±范围）。这些数据代表了两个实验。
图6。
图6。
Sp100B和Sp100HMG影响hdAd载体的表达。（A和B）HeLa细胞转染所有Sp100亚型（siSp100）mRNA中的对照siRNA（siCtrl）或混合siRNA靶向序列。（A） 48小时后，收集全细胞裂解物，用抗Sp100或抗α-微管蛋白进行免疫印迹分析。（B） 转染48小时后，用hdAd-prok或-euk（MOI，1IU/cell）感染细胞。第二天，测定细胞裂解物的β-Gal活性（平均值±标准误差；n个= 3). 星号表示显著差异。（C和D）HeLa细胞转染pcDNA3或携带FLAG标记的Sp100A、Sp100B或Sp100HMG的质粒。（C） 20小时后，收集全细胞裂解物，用抗FLAG和抗α-微管蛋白进行免疫印迹分析。（D） 转染后一天，用hdAd-prok或-euc（MOI，1IU/细胞）感染细胞。第二天，测定细胞裂解物的β-Gal活性（平均值±标准误差；n个= 2).
图7。
图7。
Daxx有助于抑制hdAd-prok转基因表达。（A） 用空载体或编码野生型或突变型（delDID）pp71的质粒转染HeLa细胞。第二天，用hdAd-prok或-euc（MOI，1IU/细胞）感染细胞；24小时后，测定β-Gal活性（平均值±标准误差；n个= 3). 星号表示存在显著差异。（B） 用对照siRNA（siCtrl）或Daxx mRNA（siDaxx）中的混合siRNA靶向序列转染HeLa细胞。转染后48小时，用hdAd-prok或-euk（MOI，1IU/cell）感染细胞；24小时后，测定β-Gal活性（平均值±标准误差；n个= 2).
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