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.2009年5月；83（10）：4749-56。
doi:10.1128/JVI.02585-08。 Epub 2009年3月11日。

一组有限的I类组蛋白去乙酰化酶可抑制人类免疫缺陷病毒1型的表达

卡拉·S·基迪 1, 南茜·M·阿尔金, 亚当·盖茨, 艾米·埃斯佩塞思, 达里亚·哈祖达, 大卫·M·马戈利斯
附属公司

一组有限的I类组蛋白去乙酰化酶可抑制人类免疫缺陷病毒1型的表达

卡拉·S·基迪等。 J维罗尔. 2009年5月.

摘要

静止的CD4（+）T细胞中整合的人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）基因组的沉默是感染持续存在的重要原因，使病毒能够逃避免疫检测和药物攻击。非选择性组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂能够诱导潜伏感染细胞中静止HIV-1的表达。然而，有效的全局HDAC抑制可诱导宿主毒性。为了确定调节HIV-1转录的特定HDAC，我们评估了HIV-1阳性、无症状患者静止CD4（+）T细胞中HDAC1到HDAC11 RNA的表达、蛋白表达和分隔。HDAC1、-3和-7在这些细胞中具有最高的mRNA表达水平。虽然通过Western blot分析在静止的CD4（+）T细胞中检测到所有HDAC，但HDAC5、-8和-11主要被隔离在细胞质中。使用染色质免疫沉淀分析，我们在Jurkat J89GFP细胞中检测到HIV-1启动子处的HDAC1、-2和-3。小干扰RNA对HDAC的靶向抑制表明，HDAC2和HDAC3有助于抑制HeLa P4/R5潜伏期细胞系模型中HIV-1长末端重复表达。总之，这些结果表明，针对有限数量的I类HDAC的HDAC抑制剂可能为阻断持续HIV-1感染提供了一种有针对性的方法。

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图1。
图1。
静止CD4中HDAC mRNA的表达+禽流感病毒1型阳性患者的T细胞。（A） HDAC1、-3和-7是静止CD4中最高表达的HDAC mRNA+T细胞。静息CD4 mRNA表达的微阵列分析+来自三名HIV-1阳性患者的T细胞提供了HDAC mRNA表达的相对强度。（B） 在静止的CD4中可检测到HDAC1至-11+T细胞。从静止的CD4中获得全细胞提取物+对HIV-1阳性患者的T细胞和20μg蛋白用HDAC1至-11特异性抗体进行Western blot分析。抗核膜标记层粘连蛋白B1的抗体被用作负荷对照。作为抗HDAC10抗体的阳性对照（+），对转染HDAC10表达质粒的293T细胞的2μg全细胞提取物进行Western blotting。尽管在所示的实验中，患者提取物中未检测到HDAC10，但在分析40μg提取物时检测到了HDAC10（数据未显示）。
图2。
图2。
HDAC5、-8和-11被排除在静止CD4细胞核之外+T细胞。静止CD4+在采集细胞裂解物之前，将来自禽流感病毒1型阳性患者（图1A中的患者5）的T细胞保存在培养基中（休息），或通过与1μg/ml有丝分裂原PHA孵育过夜（Act）来激活T细胞。蛋白质被分离成核（N）和细胞质（C）组分，并在Western blot分析中用靶向HDAC1至-11的抗体探测15μg提取物。抗层粘连蛋白B1和甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体用于评估核和细胞质裂解物的负荷。HDAC5、-8和-11主要定位于CD4的细胞质+T细胞。PHA激活T细胞后，HDAC7表达增加，并在细胞质中隔离，而HDAC11表达减少。
图3。
图3。
在J89GFP细胞系潜伏期模型中，HDAC1、-2和-3被招募到HIV-1 LTR中。（A） HDAC在J89GFP细胞中的定位与静止CD4中的定位相似+T细胞。用抗HDAC1至-11的抗体在Western blot分析中检测J89GFP细胞的核（N）和细胞质（C）蛋白提取物（各30μg）。靶向层粘连蛋白B1和α-管蛋白的抗体分别用作核质提取物和细胞质提取物的负荷对照。（B） HDAC1、-2和-3与HIV-1 LTR相关。靶向核I类HDACs的抗体HDAC1，-2和-3用于J89GFP细胞的ChIP分析。兔IgG血清用于检测LTR DNA的非特异性免疫沉淀。（C） 核II类HDAC HDAC4、-6和-7与HIV-1 LTR无关。在J89GFP细胞中进行ChIP分析。HDAC2作为阳性对照，兔IgG血清作为阴性对照。图B和图C中的值表示通过定量PCR测定的LTR DNA相对于IgG阴性对照物的富集。实验至少进行了三次。数据表示为平均值±平均值标准误差。
图4。
图4。
HDAC2和HDAC3负性调节HIV-1 LTRlacZ公司表达式与模拟控件的比较(n个= 64; ***,对< 0.001). 用靶向I类HDACs HDAC1、-2、-3和-8的siRNA转染P4/R5细胞。转染后20小时，细胞与1%二甲基亚砜（载体对照）再孵育20小时。作为对照，细胞转染非特异性（NS）siRNA。数值以相对光单位显示，并来自细胞裂解物的Gal-Screen分析。（B） HDAC3的siRNA敲除与HDAC抑制剂TSA亚最大浓度的暴露同时上调LTR-drivenlacZ公司与模拟转染并暴露于TSA的细胞相比的表达(n个= 32; ***,对< 0.001). 除添加1μM TSA代替DMSO外，其他细胞均按面板A处理。（C） 与模拟对照组相比，HDAC敲除后的细胞增殖没有差异(n个= 12,对对于二甲基亚砜实验，=0.522；n个= 12,对=0.307（对于TSA实验）。alamarBlue分析用于评估面板A和B中的细胞活力。面板A至C中的数据是至少三次实验的综合结果，表示为平均值±标准误差。
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