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.2004年5月10日；165(3):313-21.
doi:10.1083/jcb.200311076。

布氏锥虫高尔基体复制

辛西娅·Y·何 1, 海伦·H·何, 乔格·马利森, 塞西尔·沙洛尼, 克里斯托弗·M·韦斯特, 伊丽莎白·乌尔鲁, 德里克·图姆, 格雷厄姆·沃伦
附属公司

布氏锥虫高尔基体复制

辛西娅·Y·何等。 J细胞生物学. .

摘要

在原生动物寄生虫布氏锥虫（Trypanosoma brucei）中复制单个高尔基体后，用GFP变体标记假定的高尔基酶和基质蛋白。视频显微镜显示，新高尔基体在细胞周期开始约两个小时后，在旧高尔基体附近从头出现，并在两个小时内生长，直至与旧高尔基体形相同。内质网（ER）输出位点的复制遵循完全相同的时间过程。光漂白实验表明，新高尔基并不是新ER出口点的独家产品。相反，它至少部分是由旧高尔基人直接提供的材料提供的。药理实验表明，新高尔基体和内质网出口的位置取决于新基底体的位置。

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图1。
图1。
蛋白质特性布氏锥虫标记。全细胞裂解物（5×106通过SDS-PAGE对野生型（wt）寄生虫（1和3道）和稳定表达Tb-GRASP-GFP（2和4道）、GntB-YFP（5道）或Tb-Sec13p-YFP的细胞（6道）进行分离，并进行免疫印迹处理。针对Tb-GRASP的多克隆抗体显示，野生型寄生虫（第1道）中有一个单一的55-kD蛋白，而稳定表达Tb-GRASP-GFP的寄生虫（第2道）中又有一个额外的84-kD蛋白质，该蛋白也与GFP的多克隆抗抗体发生反应（第4道）。稳定表达GntB-YFP或Tb-Sec13p-YFP的细胞各自产生一种被抗GFP抗体识别的蛋白质（分别为第5和第6道）。
图2。
图2。
标记的特征 布氏锥虫 高尔基和ER出口站点。（A、C、E和G）细胞周期早期固定细胞的荧光显微镜显示单个高尔基体结构（红色，使用Tb-GRASP[A、E和G]抗体观察，或绿色，Tb-GRASP-GFP[C]荧光）、单个鞭毛（灰色；使用抗PAR）、单个细胞核（蓝色；DAPI），和单个动粒（含有线粒体DNA的较小蓝色结构；DAPI）。请注意，假定的高尔基酶标记GntB-YFP（E，绿色）和基质标记Tb-GRASP（E，红色）共定位（黄色），而ER输出位点标记Tb-Sec13p-YFP，（G，绿色）标记与高尔基密切相关的结构（G，红色）。（B，D，F，和H）使用Tb-GRASP（B）或GFP（D，F和H）抗体对野生型寄生虫（B）、稳定表达Tb-GRASP-GFP（D）、GntB-YFP（F）或Tb-Sec13p-YFP的细胞进行免疫标记。使用10 nm蛋白A–金显示抗体。请注意，基质（GRASP）和假定酶（GntB）标记定位于高尔基体堆栈，而内质网输出位点标记（Tb-Sec13p）定位于高尔基体堆栈和相关内质网之间。
图3。
图3。
高尔基体的生物发生和内质网输出位点。（A） 在一个细胞周期内对稳定表达高尔基体标记物Tb-GRASP-GFP的细胞进行成像，并将荧光图像和相位图像合并。选定的图像显示了新高尔基体（箭头）的生长以及随后出现的较小高尔基体的外观（箭头）。请注意，新高尔基体总是比旧高尔基体更靠近细胞的残端（后部）。完整的图像序列作为视频1提供（可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200311076/DC1). （B） 在一个细胞周期内对稳定表达Tb-GRASP-CFP（左）和Tb-Sec13p-YFP（右）的细胞进行成像（视频2）。选定的时间点说明了高尔基体和ER出口站点在复制（箭头）和后续生成其他较小结构（箭头）期间的重合组装。棒材，5μm。
图4。
图4。
使用FRAP分析确定新高尔基成分的来源。（A） 将稳定表达假定高尔基酶GntB-YFP的细胞中的新高尔基体（红色圆圈）进行光漂白，并在新旧高尔基体之间等距放置漂白棒（绿色；10-s漂白，50s休息）的情况下恢复。然后移除漂白棒（底部）以进行恢复。（B） 使用BiP（ER）抗体固定相同的细胞并标记ER。与DIC图像（DIC）的比较显示，ER弥漫于整个细胞浆。新旧高尔基体（Golgi）之间的绿色条是用于重复光漂白的代表。请注意，它覆盖了ER的一小部分（与DNA合并）。棒材，5μm。
图5。
图5。
光漂白后回收率的定量。（A） 新高尔基体光漂白后的恢复。注意，与对照组（蓝色菱形）相比，在存在光漂白棒（红色方块）的情况下，速率和程度被延迟，但当棒被放置在新高尔基体（黄色三角形）的另一侧上相同的距离时，速率和程度没有被延迟。（B） 移除光浸出棒后的恢复。30分钟（箭头所示）后移除杆，可以完全恢复新高尔基球。（C） 一根较长的光漂白棒横切整个细胞（黑色方块），与正常棒相比，其对新高尔基体恢复的抑制作用不超过细胞宽度的约1/3（红色方块）。（D） 光漂白后，旧高尔基体的恢复不受放置在两个高尔基体之间的杆的影响。（E） 完全生长的新高尔基体（与旧高尔基体大小相同）的恢复不受两个高尔基体之间的光漂白条的影响。（F） 在稳定表达Tb-Sec13p-YFP的寄生虫中漂白新的ER输出位点。回收率不受光漂白棒的影响。（G） 旧高尔基体的重复光漂白抑制了新高尔基体恢复。（H） 新高尔基体的重复漂白并没有影响旧高尔基体的恢复。A–F中的结果表示为平均值±SD(n个=5），G和H中的结果表示为平均值±SD(n个=3）。对于实验过程中的光漂白，荧光回收率以预浸值的百分比计算，无论是否校正（a–E）（G和H）（见材料和方法）。
图6。
图6。
新高尔基体合成的位置由新的基体决定。（A） 细胞周期不同阶段的固定寄生虫被标记为高尔基体（红色；抗Tb-GRASP）、基底体（绿色；YL1/2抗体）、鞭毛（灰色；抗PAR）和DNA（蓝色；DAPI）。请注意，抗PAR抗体仅标记鞭毛的暴露部分（鞭毛囊外），因此鞭毛基底和基底体之间存在间隙。（B） 用茴香素p处理寄生虫，以防止基底体分离和随后的细胞分裂。（C） 寄生虫被根霉毒素处理以防止细胞核分离，因此产生了一个有两个细胞核的子寄生虫（左）和一个没有细胞核的子疟原虫（右）。注意高尔基体和基底体在所有细胞周期阶段（A）和药物治疗后（B和C）的严格空间关系。棒材，5μm。
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参考文献

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