芪灵汤通过抑制去势耐药前列腺癌自噬增强阿比特龙治疗

摘要

简介

根据2020年癌症统计数据，前列腺癌是全球癌症相关流动性和死亡率的第二大原因[1]。晚期前列腺癌转移到其他器官的患者五年生存率低，预后差。在21世纪初之前，只有最低限度的化疗药物（即阿霉素、环磷酰胺或表阿霉素）可用于晚期前列腺癌的治疗。然而，研究表明，它们能提供微小的生存益处[2，三]。自从批准对转移性前列腺癌使用化学激素制剂（即醋酸阿比特龙、苯扎鲁胺）以来，这些精液化学激素疗法显著延长了晚期前列腺癌患者的总体生存期[4–6].

醋酸阿比特龙是雄激素生物合成的抑制剂[7]。由于前列腺癌需要睾酮生长，即使在身体的其他部位，醋酸阿比特龙也可以通过减少睾酮的生成来抑制前列腺癌，尤其是抗去势前列腺癌的生长。然而，长期使用醋酸阿比特龙后，不可避免地会产生对醋酸阿比特龙的耐药性[8]。因此，对去势耐药前列腺癌患者来说，寻找新的药物来克服阿比特龙醋酸酯耐药并提高治疗效果至关重要。

东亚国家广泛使用中草药治疗各种疾病，包括癌症[9–11]。虽然详细的分子机制研究仍处于早期阶段，但在多种中草药中已观察到有效的抗肿瘤作用，如姜黄素、白藜芦醇、黄芩素、橄榄苦苷等[11–15]。我们小组报告称，芪灵汤能够通过调节去势耐药前列腺癌细胞中miRNAs介导的糖酵解作用来抑制前列腺癌对多西紫杉醇的耐药性[16]。此外，我们还发现芪灵汤抑制胃癌细胞的侵袭和迁移，PI3K/Akt信号可能参与了胃癌细胞的浸润和迁移[17].

受这些发现的启发，我们旨在研究QLD和阿比特龙联合治疗阿比特龙耐药前列腺癌的协同作用，并探讨其潜在的分子机制。

结果

阿比特龙耐药前列腺癌细胞系的建立

为了研究阿比特龙的杀伤作用，用不同浓度的阿比特龙处理PC3、PC3-AbiR、DU145和DU145-AbiR细胞48小时。使用CCK-8分析测定细胞活力。如所示图1A，​、1B、，1B年，PC3-AbiR和DU145-AbiR的细胞存活率显著高于其对应物（PC3和DU145），证实成功建立了阿比特龙耐药前列腺癌细胞系（PC3-Abi R和DU141-AbiR）。

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图1

PC3-AbiR对阿比特龙的耐药性(一个)和DU145 AbiR(B类)单元格。用不同浓度的阿比特龙处理细胞48小时，计算细胞存活率。数据表示为平均值±标准偏差。n=3**p<0.01。

QLD增强阿比特龙对PC3-AbiR和DU145-AbiR的细胞毒作用

为了解决QLD是否会降低PC3-AbiR和DU145-AbiR的抗阿比特龙能力的问题，这些细胞株被PBS（对照）、QLD、阿比特酮（Abi）或QLD和阿比特隆（QLD+Abi）联合治疗48小时。流式细胞术和CCK-8法分别测定细胞凋亡率和存活率。如所示图2A，​、3A、，3A级QLD单独使用对细胞的杀伤作用可以忽略不计，而Abi-alone导致PC3-AbiR和DU145-AbiR的细胞凋亡增加。有趣的是，QLD+Abi处理导致PC3-AbiR和DU145-AbiR的细胞凋亡更强烈。细胞存活结果显示出与凋亡结果类似的趋势(图2B，​，3B），3B公司)表明QLD增强了Abi对PC3-AbiR和DU145-AbiR细胞的杀伤作用。

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图2

QLD降低PC3-AbiR细胞对阿比特龙的抵抗能力。(一个)采用流式细胞仪分析PC3-AbiR细胞凋亡情况，计算凋亡率。(B类)用CCK8试剂盒检测各组PC3-AbiR细胞的存活率。数据表示为平均值±标准偏差。n=3*p<0.05，**p<0.01。

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图3

QLD降低了DU145-AbiR细胞的抗阿比特龙能力。(一个)采用流式细胞仪分析DU145-AbiR细胞的凋亡情况，计算凋亡率。(B类)用CCK8试剂盒检测各组PC3-AbiR细胞的存活率。数据表示为平均值±标准偏差。n=3*p<0.05，**p<0.01。

QLD降低PC3-AbiR和DU145-AbiR中阿比特龙诱导的自噬

为了阐明自噬是否参与QLD+Abi对细胞死亡的协同作用，用GFP-LC3质粒转染PC3-AbiR和DU145-AbiR细胞，并暴露于对照、QLD、Abi或QLD+Abi处理。在荧光显微镜下检查以绿色（GFP）点状信号表示的自噬体。中的结果图4A，​，4B级4B类结果表明，与对照组或QLD组相比，Abi组的GFP-LC3点显著增强。QLD+Abi组GFP-LC3点也显著高于QLD组，但显著低于Abi组。这些结果表明QLD降低了Abi组自噬体的形成。

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图4

QLD逆转了阿比特龙在PC3-AbiR和DU145-AbiR细胞中诱导的自噬。通过计算PC3-AbiR中GFP-LC3点来量化自噬(一个)和DU145-AbiR(B类)单元格。数据表示为平均值±标准偏差。n=3*p<0.05，**p<0.01。

QLD降低PC3-AbiR和DU145-AbiR中阿比特龙诱导的LC3-II和Becline 1水平

接下来，用对照、QLD、Abi或QLD+Abi处理PC3-AbiR和DU145AbiR细胞。通过Western印迹分析测定这些细胞中LC3-I、LC3-II、Beclin 1和GAPDH的表达水平。如所示图5A–5楼，与对照相比，在PC3 AbiR和DU145 AbiR细胞中，Abi暴露诱导了LC3-II/LC3-I比率和Beclin 1水平的显著上调。添加QLD后，Abi对LC3-II/LC3-I比率和Beclin 1表达的促进作用部分恢复，证实QLD降低了Abi诱导的PC3-AbiR和DU145-AbiR细胞自噬体的形成。

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图5

QLD处理显著降低PC3-AbiR和DU145-AbiR细胞中的LC3-II和Beclin 1。(一个)Western blot检测PC3-AbiR细胞中LC3-II/LC3-I和Beclin 1的蛋白水平。(B类，C类)显示相对蛋白表达。(D类)Western blot检测DU145-AbiR细胞中LC3-II/LC3-I和Beclin 1的蛋白水平。(E类，F类)显示相对蛋白表达。数据以平均值±标准偏差表示。每组n=3*p<0.05，**p<0.01。

QLD促进阿比特龙对PC3-AbiR和DU145-AbiR的抗肿瘤作用

最后，为了研究QLD+Abi对阿比特龙耐药前列腺癌细胞株的肿瘤抑制作用，用对照、QLD、Abi或QLD+Abi治疗PC3-AbiR-或DU145-AbiR-荷瘤小鼠图6A–第6天在PC3-AbiR和DU145-AbiR肿瘤模型中，QLD单独使用不影响肿瘤生长，而Abi-alone显著降低PC3-Abi和DU145-AbiR的肿瘤生长，证实QLD能够增强阿比特龙的肿瘤生长抑制作用体内.

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图6

QLD增强了小鼠的阿比特龙治疗。音量(一个)和重量(B类)PC3-AbiR荷瘤小鼠各组皮下异种移植物的数量和体积(C类)和重量(D类)分析各组DU145-AbiR荷瘤小鼠皮下移植瘤的数量。数据以平均值±标准偏差表示。每组n=8*p<0.05，**p<0.01。

讨论

QLD是一种中药，从昆山、姜黄、生黄芪等多种草药中提取而成。以往的研究已经证明QLD对人类癌症具有潜在的抗肿瘤作用。例如，Chen等人报告说，QLD可以通过阻断PI3K/AKT信号通路来抑制胃癌细胞的迁移和侵袭[17]。临床研究证明，QLD能够减少胃癌复发，提高胃癌患者的生活质量。同样，Cao等人表明QLD增强了多西他赛对多西他素耐药前列腺癌细胞的细胞毒性作用[12，18]。有趣的是，即使是从QLD中八种草药之一提取的单一成分也显示出抗肿瘤作用。瞬间，从黄芪中提取的黄芪多糖能够诱导胃癌细胞凋亡，并抑制乳腺癌细胞的生长[19，20]。姜黄中的姜黄素已被证明具有多种健康益处，包括对乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结肠癌的抗肿瘤作用[21–23]。苦参注射液是另一种中药，在中国医院用于癌症治疗已有20多年[24，25]。根据这些发现，我们报告称，QLD单独使用既不会诱导阿比特龙耐药前列腺癌细胞的凋亡，也不会抑制其肿瘤生长，这意味着QLD对健康细胞/组织也是安全的。重要的是，QLD显著促进了阿比特龙对PC3-AbiR和DU145-AbiR细胞的抗肿瘤作用，如凋亡率增加所示在体外和深度的肿瘤生长抑制体内.

自噬是一个分解代谢过程，受损的细胞器、无用的蛋白质或其他细胞质内、外成分被包裹在双层膜囊泡中，并被运输到溶酶体进行降解[26]。细胞可以回收大量分子以重建细胞器，同时去除潜在的有害物质，包括抗癌药物。因此，自噬对维持健康的细胞环境至关重要[27–29]。人们普遍认为，控制水平的自噬可促进细胞存活，而自噬的过度激活可加速细胞凋亡[30]。在我们的研究中，我们发现阿比特龙治疗诱导了PC3-AbiR和DU145Abir细胞中自噬体的显著上调，这意味着这些阿比特龙抗性前列腺癌细胞可以通过将阿比特龙螯合到自噬体中并输送到溶酶体进行降解来有效消除阿比特龙。这种能力赋予PC3-AbiR和DU145-AbiR细胞抗阿比特龙的能力。值得注意的是，添加QLD显著减少了经阿比特龙治疗的PC3-AbiR和DU145-AbiR细胞中的自噬体形成。因此，我们认为QLD通过抑制自噬活性，部分恢复了PC3-AbiR和DU145-AbiR细胞的阿比特龙敏感性。

虽然我们的发现表明QLD能够促进PC3-AbiR和DU145-AbiR细胞对阿比特龙的敏感性，但一些尚未解决的问题值得进一步研究。例如，QLD如何影响自噬体形成的详细分子机制尚不清楚。为了支持QLD在前列腺癌患者中的临床应用，迫切需要在各种动物或临床研究中进行QLD的剂量递增研究。

结论

在本研究中，我们首次证明QLD能够促进阿比特龙处理的PC3-AbiR和DU145-AbiR细胞的凋亡和细胞死亡在体外增强阿比特龙对PC3-AbiR和DU145-AbiR细胞的抑瘤作用体内进一步的研究表明，QLD通过调节自噬来调节PC3-AbiR和DU145-AbiR细胞的阿比特龙敏感性。

材料和方法

脚注

参考文献