阿片肽参与脊髓刺激大鼠神经病理性疼痛模型的镇痛作用

外科

SCS导线的植入

SNI手术后三天（图。​（图1A），1A） ，对表现出机械性超敏反应的大鼠进行L1和T12水平的椎板切除术，这对应于L4–L6腰椎脊髓区域。专门为大鼠设计的SCS导线（中国北京品思医疗有限公司）包含三个间隔2 mm的接触点（图。​（图2A）。2A） ●●●●。该导线沿嘴侧方向插入硬膜外，并用缝合线固定在肌肉和韧带上。伤口用缝合线闭合，导线的远端从颈部底部的皮肤中穿出，并固定在头部，以便稍后连接到外部神经刺激器（T902，北京品思医疗有限公司，中国）。施加2 Hz的刺激，如果电极放置得当，则可获得中下躯干、同侧后肢或尾巴的运动收缩。

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图1

实验设计。A类SNI模型的动物制备以及SCS电极和鞘内导管的植入。B类30分钟SCS程序。C类不同强度的SCS。D类不同频率的短期SCS和CSF采集。E类24小时不同频率的SCS和CSF采集。脊髓刺激；PWT，缩爪阈值；SNI，避免神经损伤；MT，电机阈值；脑脊液。

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图2

导线植入说明和导线位置的X射线验证。A类导线尺寸和植入导线的位置。B类植入电极相对于椎骨和肋骨的位置通过X射线验证。通过计算肋骨的数量来识别T13–L1椎骨：13^第个肋骨吻侧附着在13只^第个胸椎。

在研究之前，测试了所有动物的阻抗和运动阈值（MT）。阻抗表示电极在脊髓-硬膜外间隙中的功能状态，0–1 kΩ表示两个触点之间存在短路，1–10 kΩ表示电极处于工作状态，1–10MΩ表示两触点之间存在开路状态。在SCS之前测量，平均阻抗为3.99±0.11 kΩ（图。​（图3A）三A） 电极植入后3天。11天后，它增加到~6 kΩ，并保持在这个水平。通过缓慢增加SCS的振幅（以0.01-mA为增量），从零开始以2 Hz，200μs的脉冲宽度，直到观察到中下躯干或后肢的肌肉收缩，来测定MT。

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图3

SCS在神经病理性疼痛大鼠模型中镇痛作用的表征。A类，B类阻抗变化的时间进程A类和电机阈值B类SCS电极植入后。C1类在50 Hz脊髓刺激30分钟期间和之后，重度和中度机械性超敏大鼠的50%PWT。指挥与控制根据以下公式计算的平均50%PWTC1类.Pre-SCS，0 min时50%PWT inC1类; 在SCS期间，15分钟和30分钟的平均PWTC1类; SCS后，60 min时50%PWTC1类使用Dunnett多重比较检验的重复方差分析**P（P）< 0.01与预-SCS；^###P（P）< 0.001与Dur-SCS中度和重度机械过敏之间的50%PWT。

机械敏感性评估

按照Dixon的描述，对大鼠的爪子撤退阈值（PWT）进行了测试[19]. 将大鼠放置在带有金属网底部的塑料笼中，使其完全接触到爪子，以适应约30分钟的环境，直到笼探索和主要梳理活动停止。测试区域是腓肠神经分布中的后爪外侧表面。使用校准的von Frey纤维测试PWT，弯曲力范围为0.4至15.0 g（8根纤维：0.4、0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和15.0 g）。根据Dixon的升降法，在系列中间开始使用2.0 g灯丝进行测试。根据大鼠是否抬起爪子决定退出。如果出现正撤回，则施加额外的减小力。如果出现负撤回，则施加更大的力。使用查普兰描述的50%PWT方法计算PWT等. [20].

30分钟SCS程序

SNI手术后7天，这些动物开始接受SCS（图。​（图1A）。1A） ●●●●。X射线显示的位于T13–L1椎体中的触点被选作阳极和阴极（图。​（图2B）。2B） ●●●●。选择三个电极中的任意两个覆盖包含T13–L1段的区域。通常，中间触点被设置为阴极。将大鼠放在金属丝网上约30分钟进行习服，然后测定基线50%PWT。之后，实施了30分钟的SCS；在SCS启动后的15分钟和30分钟，以及SCS终止后的15 min和30分钟再次获得50%的PWT（图。​（图11B） ●●●●。

入选和排除标准

如果基线50%PWT<1 g或>6 g，SNI大鼠将被排除在主要研究之外。然而，将50%PWT<1 g的动物作为严重机械超敏反应的亚组进行分析。电极未覆盖X光检查证实的T13–L1水平的动物也被排除在外。

实验设计

选择性阿片受体拮抗剂的实验设计

阿片受体拮抗剂D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Orn-Thr-Pen-Thr-NH₂（CTOP，ab120078，美国Abcam）和去甲萘酚胺（nor-BNI，P5296，美国Sigma）新鲜溶解在盐水中。Naltrindole（NTI，B6429，APExBIO，USA）新鲜溶解在10%二甲基亚砜中。所有药物溶液在给药前均预热至37°C。静脉注射药物后，用10μL预先加热的生理盐水冲洗导管。在SNI手术后11、12、13、14、15和16天，在（2、100 Hz和10 kHz）SCS前30分钟注射拮抗剂，测试任何两个频率之间的24小时洗脱期。在80%MT电流和200μs脉冲宽度（10kHz时为30μs）的情况下获得了50%的PWT。

各实验组的治疗总结见表​表1。1CTOP实验中的大鼠被分为三组：第1组-幼稚（no-SNI，n个= 9); 第2组-对照组（SNI，no-SCS，n个=9），和组3–SCS（SNI，SCS，n个= 9). 为了避免偏差，测试频率的顺序安排为3只大鼠按2、100 Hz和10 kHz的顺序接受SCS（表​（表2）；2); 3只100Hz、10kHz和2Hz的大鼠；和3只10kHz、2Hz和100Hz的大鼠。

NTI实验中的大鼠被分为三组：第1组-幼稚（no-SNI，n个=9）；第2组-对照组（SNI，no-SCS，n个=11）和第3组（SNI、SCS，n个= 10). 为了避免偏差，测试频率的顺序安排为3只大鼠按2、100 Hz和10 kHz的顺序接受SCS（表​（表3）；三); 4只100Hz、10kHz和2Hz的大鼠；和3只10kHz、2Hz和100Hz的大鼠。

将Nor-BNI实验中的大鼠分为三组：第1组-幼稚（no-SNI，n个= 10); 第2组-对照组（SNI，no-SCS，n个=11），组3–SCS（SNI，SCS，n个= 10). 为了避免偏差，频率序列的安排方式是，3只大鼠接受SCS，顺序为2、100 Hz和10 kHz（表​（表4）；4); 3只100Hz、10kHz和2Hz的大鼠；4只大鼠，频率分别为10 kHz、2 Hz和100 Hz。

酶联免疫吸附试验（ELISA）

麻醉下SCS 30分钟后立即从延髓池收集脑脊液（CSF）。蛋氨酸脑啡肽（Met-enk）的浓度是按照商业ELISA试剂盒（MBS756126，MyBiosource，Inc.，San Diego，USA）的说明进行测定的。

SCS镇痛与机械过敏的严重程度

以前的研究结果表明，SCS的镇痛作用受模型机械过敏严重程度的影响[23，24]. 在重度和中度机械性超敏反应动物中检测SCS的镇痛作用：中度机械性过敏大鼠的50%PWT从3.42±0.72 g显著增加到9.79±3.56 g(P（P）<0.01），在15分钟SCS期间（图。​（图3C1）。三C1）。50%的PWT几乎恢复到手术前水平。同时，严重机械性超敏反应大鼠的50%PWT仅从前SCS水平0.55±0.10 g增加到1.89±1.10 g(P（P）>0.05）（图。​（图3C1）。三C1）。为了比较SCS对重度和中度机械性超敏反应动物的镇痛作用，测量SCS期间50%的PWT（Dur-SCS）；这表示SCS启动后15 min（15 min-SCS）和30 min（30 min-SCS。数据表明，中度机械过敏大鼠（8.85±2.77 g）的Dur-SCS 50%PWT比Pre-SCS水平（3.42±0.72 g）显著增加(P（P）<0.01，图。​图3C2），三C2），表明疼痛阈值增加。中度机械性超敏大鼠的Dur-SCS也显著高于重度机械性超敏感大鼠（1.20±0.53 g，P（P）<0.01，图。​图3C2），三C2），表明SCS在具有中度机械性超敏反应的大鼠中产生更好的镇痛作用。

刺激强度-镇痛反应关系

采用20%MT至80%MT的不同刺激强度研究刺激强度与镇痛效果之间的关系。结果显示，除了40%MT外，刺激强度与止痛效果之间存在强度-反应关系（图。​（图4A1，4A1、A2和表S1）。

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图4

不同强度和频率的SCS对短期SCS的镇痛作用，以及4种频率持续延长SCS的作用。A1、A2在50 Hz的SCS不同MTs下镇痛作用的时间过程。中度机械性超敏大鼠的50%PWT呈强度依赖性和可逆性升高（另见表S1）。似乎需要60%MT或以上的SCS才能产生可靠的镇痛效果。地下一层、地下二层SCS在80%MT的不同频率下镇痛作用的时间过程。SCS的所有频率（2、15、50、100 Hz、10 kHz和2/100 Hz交替频率）在中度机械过敏大鼠中显示出相似程度的镇痛作用。对于短期SCS，Pre-SCS表示0 min时的50%PWTA1类和地下一层; 在SCS期间，15分钟和30分钟的平均PWT地下一层; SCS后，60 min时50%PWTA1类和地下一层.C1、C2在四种频率下延长80%MT SCS期间和之后50%PWT变化的时间过程。在2、50、100 Hz和10 kHz下延长SCS达24小时，具有类似的持续镇痛效果。除50Hz组外，SCS终止后1h镇痛效果消失。预-SCS，时间为0 in时为50%PWTC1类; 在SCS期间，从2小时到24小时，平均每2小时50%的PWTC1类; SCS后，25小时内50%PWTC1类用Dunnett的多重比较检验进行重复方差分析**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001与预-SCS；^#P（P）< 0.05,^##P（P）< 0.01,^###P（P）< 0.001与No-SCS组中的Dur-SCS。

无刺激频率-镇痛反应关系

我们以前的研究表明，EA的镇痛作用是频率依赖性的[15，25，26]. 因此，我们检测了SCS在6种不同频率（2-、15-、50-、100-Hz SCS、10-kHz SCS和2/100-Hz交替SCS）下的镇痛效果。与No-SCS组自身的Pre-SCS值或Dur-SCS值相比，SCS后各频率组的50%PWT都有类似的增加（图。​（图4B14B1和B2）。这些频率组之间的镇痛效果没有显著差异（表S2）。

持续性脊髓刺激诱发的持续性镇痛

为了在临床情况下模拟SCS的长期治疗，在连续24小时刺激期间评估SCS在四个选定频率（2、50、100 Hz和10 kHz）下的镇痛效果。在整个24小时治疗期间，每隔一小时收集50%的PWT数据。在24小时内，所有四个频率的SCS都具有相似的延长镇痛作用（图。​（图4C1，4C1、C2；2-Hz Pre-SCS：3.78±0.75 g，Dur–SCS：8.21±0.96 g；50-Hz Pre-SCS：3.63±0.31克，Dur-SCS：9.21±0.79克；100-Hz Pre-SCS：3.21±0.47克，Dur–SCS：8.56±0.85克；10-kHz预-SCS：3.02±0.48 g，Dur-SCS：9.10±0.60 g）。在任何频率组之间均未发现显著差异（表S3）。持续刺激24小时，镇痛效果持续，无任何耐受迹象。测定了24小时SCS的后效。SCS终止后60分钟，所有频率组的50%PWT值恢复到预刺激基线水平，50Hz组除外（图。​（图4C1，4C1、C2和表S3）。这与电针镇痛形成鲜明对比，电针镇痛在长时间刺激>6小时后出现耐受性，表明两种干预措施之间的潜在镇痛机制存在重大差异。

阿片受体参与SCS的镇痛作用

2-Hz SCS后50%PWT的增加被MOR特异性拮抗剂CTOP和KOR特异性阻断剂Nor-BNI阻断，但DOR特异性抑制剂NTI没有阻断（图。​（图5，5，表S4和S5），表明MOR和KOR参与调节2-Hz SCS的镇痛作用。

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图5

阿片受体拮抗剂对2-Hz SCS镇痛作用的影响。A1、A2MOR特异性拮抗剂CTOP（3和10μg）显著减弱镇痛作用。地下一层、地下二层NTI（3和10 mg/kg）是一种DOR特异性拮抗剂，不影响镇痛效果。C1、C2KOR特异性拮抗剂Nor–BNI（5.74和22.96μg）显著降低镇痛效果。预-SCS，0 min时50%PWTA1类，地下一层、和C1类; 在SCS期间，15分钟和30分钟的平均PWTA1类，地下一层、和C1类; SCS后，60 min时50%PWTA1类，地下一层、和C1类用Dunnett的多重比较检验进行重复方差分析*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）< 0.001与预-SCS；^#P（P）< 0.05,^##P（P）< 0.01,^###P（P）< 0.001与SCS+Veh组中的Dur-SCS。CTOP，D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-On-Thr-Pen-Thr-NH₂; NTI，纳曲多尔；去甲肾上腺素、去甲肾上腺素。

KOR特异性拮抗剂Nor BNI阻断了100Hz SCS下50%PWT的增加，但CTOP或NTI没有阻断（图。​（图6，6，表S6和S7）。这些结果表明，KOR参与介导100Hz下SCS的镇痛作用。

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图6

阿片受体拮抗剂对100Hz脊髓刺激的镇痛作用的影响。A1、A2CTOP（10和30μg）是一种MOR特异性拮抗剂，不影响镇痛效果。地下一层、地下二层NTI（3和10 mg/kg）是一种DOR特异性拮抗剂，不影响镇痛效果。C1、C2KOR特异性拮抗剂Nor-BNI（5.74和22.96μg）显著降低镇痛效果。预-SCS，0 min时50%PWTA1类，地下一层、和C1类; 在SCS期间，15分钟和30分钟的平均PWTA1类，地下一层、和C1类; SCS后，60 min时50%PWTA1类，地下一层、和C1类用Dunnett的多重比较检验进行重复方差分析**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001与预-SCS；^#P（P）< 0.05,^###P（P）< 0.001与SCS+Veh组中的Dur-SCS。

10-kHz SCS的镇痛作用被测试的三种受体拮抗剂Nor-BNI、CTOP和NTI中的任何一种阻断（图。​（图7，7，表S8和S9），表明MOR、DOR和KOR均参与调节10-kHz SCS的镇痛作用。

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图7

阿片受体拮抗剂对10-kHz SCS镇痛作用的影响。A1、A2MOR特异性拮抗剂CTOP（10和30μg）显著降低镇痛效果。地下一层、地下二层NTI（3和10 mg/kg）是一种DOR特异性拮抗剂，可显著抵消超敏反应抑制作用。C1、C2KOR特异性拮抗剂Nor-BNI（5.74和22.96μg）显著降低镇痛效果。预-SCS，0 min时50%PWTA1类，地下一层、和C1类; 在SCS期间，15分钟和30分钟的平均PWTA1类，地下一层、和C1类; SCS后，60 min时50%PWTA1类，地下一层、和C1类用Dunnett的多重比较检验进行重复方差分析**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001与预-SCS；^#P（P）< 0.05,^##P（P）< 0.01,^###P（P）< 0.001与SCS+Veh组中的Dur-SCS。

SCS的镇痛作用和刺激参数

SCS的镇痛效果可能受到许多因素的影响，例如受刺激的脊髓节段、神经病理性疼痛的严重程度以及波形、脉宽、强度和频率等刺激参数。

据报道，SCS用于含有受损脊神经或以上的脊髓节段时，其镇痛效果更为有效[23，24]这与SCS的镇痛作用是基于门控理论的假设是一致的。由于SNI大鼠有来自L4、L5和L6的脊髓神经损伤，因此我们选择对应于脊髓L4、M5和M6的T13–L1椎体节段作为刺激部位。SCS诱导镇痛的门控假说也得到了以下事实的支持：持续24小时的SCS刺激后没有产生耐受性。据报道，持续6小时电针大鼠的镇痛效果显著降低[17]. 中枢内啡肽在电针镇痛作用中起重要作用[15].

在SNI模型中比较了SCS在不同程度机械性超敏反应（中度）时的镇痛作用与严重）。我们的数据表明，SCS对中度机械性过敏大鼠的镇痛更有效。这与之前报告的结果一致[23，24].

我们研究了SCS在不同强度（对应20%、40%、60%和80%MT）下的镇痛效果。可以预测，刺激强度与运动阈值内SCS的镇痛效果呈正相关（图。​（图4），4)，与以前的报告一致[27–29]. 选择80%MT对应的刺激强度来研究SCS的机制，并在神经病理性疼痛大鼠模型中产生显著的镇痛作用。

SCS的频率可以作为向中枢神经系统传递神经调制信息的独立信号。已经证明，电针或TEAS刺激周围神经以频率依赖的方式缓解疼痛[15–17]. 例如，2-Hz TEAS在减少神经病理性疼痛方面比100Hz更有效[30]. 相比之下，100-Hz TEAS对由上部神经元损伤引起的肌肉痉挛引起的疼痛更有效[31]. 我们假设SCS诱导的镇痛也具有频率特异性，因为用于外周神经刺激和SCS的脉冲几乎相同，除了这两种方式中使用的刺激强度不同。此外，初级传入神经在介导电针镇痛中起着关键作用。将电极置于脊髓背根和背角附近，SCS也可以激活这些神经。然而，与之前的一些发现类似[28，31]我们的数据显示，不同频率（2、15、50、100、2/100 Hz和10 kHz）的SCS具有相似的镇痛程度。这一发现与一些临床报告不一致，其中10-kHz SCS比传统SCS更有效[32]. 一种可能性是，患者可能无法耐受动物研究中使用的高刺激强度（80%MT）。较低频率和较高强度的SCS会产生不适感。相比之下，10-kHz刺激每单位时间提供更多能量，但不会产生不舒服的感觉异常。因此，患者在较高强度下更容易耐受。据报道，一种新的刺激模式，即差分目标复合编程SCS，比传统SCS更有效[33–36]. 不幸的是，这些刺激模式的神经化学机制还没有被完全理解，也没有被纳入本研究。

本研究结果表明，不同频率的SCS在长时间刺激后具有相似的抗伤害效果和相似的持续效果。值得注意的是，本研究仅使用了一种神经病理性疼痛的SNI模型。在得出SCS在缓解疼痛方面的频率特异性的任何结论之前，还应该研究各种疼痛的其他模型。

我们感谢中国北京品思医疗有限公司的技术援助。特别感谢傅旭（北京品思医疗有限公司）及其同事为动物研究修改SCS设备。这项工作得到了科技部国家重点研发计划（2016YFC01055012019YFD1712000）的支持。