生物工程。2021; 12(1): 4452–4463.
登德罗宾通过上调microRNA miR-381-3p降低caspase-4抑制内质网应激诱导的细胞凋亡
一上海中医药大学上海市中医医院老年科
b条中国上海中医药大学上海市中医医院急诊科
版权©2021作者。由Informa UK Limited出版，交易名称为Taylor&Francis Group。 - 数据可用性声明
当前研究期间使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。
摘要
据报道，登德罗宾可以降低血脂水平和细胞凋亡。本研究旨在利用血管内皮细胞观察石斛碱在ERS模型中的作用，并揭示石斛素治疗AS的生物学机制和途径，采用溴脱氧尿苷染色和流式细胞术检测HUVEC的增殖和凋亡。通过双荧光素酶报告物分析验证了靶结合关联。研究发现，TM处理导致miR-381-3p的低表达。Dendrobine处理不仅促进了TM诱导的HUVECs的增殖，而且抑制了TM诱导的HUVECs的凋亡。在用Dendrobine处理后，还观察到78kDa葡萄糖调节蛋白、肌醇需要酶1、胱天蛋白酶-4、C/EBP同源蛋白和胱天蛋白酶-3的表达减少。登德罗宾通过增加miR-381-3p的表达，减少ERS模型中内皮细胞的凋亡，并部分恢复细胞增殖水平。阻断miR-381-3p的表达后，这种效应显著降低。总的来说，本研究表明，石斛碱上调miR-381-3p的表达，以抑制ERS诱导的HUVEC凋亡，该过程由caspase-4介导。本研究的结果可能为研究AS期间内皮细胞凋亡的原因提供新的见解，并揭示石斛碱对AS的有效治疗作用。
关键词：登德罗宾，miR-381-3p，caspase-4，内质网应激，增殖，凋亡
介绍
动脉粥样硬化（AS）是大多数心血管疾病的主要病理基础，是当前医学中最具挑战性的问题之一[1]. AS是一个涉及多种代谢和信号通路的复杂过程。近年来，越来越多的证据表明内质网应激（ERS）与AS密切相关[2]. 血管内皮细胞的凋亡是AS的关键机制。ERS和随后的凋亡诱导在AS的早期起着重要作用[3,4].
登德罗宾广泛分布于欧洲、亚洲和大洋洲的热带和亚热带地区。登德罗宾主要来源于金钗石斛其生物活性与苦毒毒素相似。石斛被确定为第一个通过化学和光谱方法检测到的苦曲霉烷型生物碱[5,6]. MicroRNAs（miRNAs/miRs）是一类内源性小分子非编码单链RNA，由约22个单核苷酸组成。miRNA通过其种子区与其同源靶mRNA的3非翻译区（UTR）的互补碱基配对与靶相互作用[7–9]. miRNAs影响内皮功能障碍的机制之一是通过其对内皮细胞凋亡的影响[10,11]. 内皮细胞损伤可导致内皮完整性和屏障功能的破坏，并可促进脂质沉积，导致（AS）的发展[12]. 人类miR-381编码基因（hsa-miR-382）位于14号染色体长臂上，属于miR-154基因家族，参与内皮细胞的凋亡和增殖[13]. 先前的一项研究表明，与正常组相比，AS组的miR-381-3p显著下调[14]. 另一项研究报告称，miR-381-3p水平与细胞凋亡敏感性之间存在直接负相关；miR-381-3p的异位表达对caspase-3的激活具有抑制作用[15]. 登德罗宾已被证明具有降低血糖和血脂水平、发挥抗肿瘤作用、减少炎症和凋亡以及减缓细胞衰老的能力[16,17]. 然而，潜在的分子机制尚不清楚。
我们预测miR-381-3p可能参与石斛碱对AS的影响。本研究的目的是阐明石斛抑制ERS和保护人脐静脉内皮细胞（HUVECs）凋亡的分子机制，并确定miR-381-3 p在这一过程中的作用。
材料和方法
细胞和细胞培养HUVEC细胞系（ATCC®CRL-1730™American Type Culture Collection）在含有10%FBS和100 mg/l青霉素/链霉素的DMEM中培养，37°C和5%CO2内皮细胞在6孔板中培养，每两天更换一次培养基。当细胞汇合达到70-80%时，将处于增殖状态的细胞与含有1%FBS的DMEM培养24小时，以同步细胞增殖。通过使用衣霉素（TM，2μM）12 h建立ERS的HUVEC模型。牛磺脱氧胆酸（TUDCA）或石斛组中的HUVEC在TM治疗前用TUDCA或石蒜处理12小时，然后添加TM 12小时。石斛购自上海源业生物科技有限公司（HPLC≥98%，中国上海）。TUDCA被研究为内质网应激抑制剂[18,19]，在本研究中用作阳性对照组。TM用于建立ER模型，如前所述[20].
细胞计数试剂盒（CCK）-8分析HUVEC（2x104细胞）接种到96 well板中，并接受各种处理条件。24小时后，向每个孔中添加10µl CCK-8溶液（赛默飞世尔科技公司）。4小时后，使用微孔板阅读器检测450 nm处的吸光度。
溴脱氧尿苷（BrdU）染色HUVEC（1.5x105/ml）接种到细胞培养皿中。在实验干预后，将BrdU（Thermo Fisher SCIENTIFIC.Inc）添加到细胞培养皿中，然后在37°C下培养40分钟。然后丢弃培养基，用100%甲醇固定细胞10分钟。随后，用AlexaFluor®647抗-BrdU抗体（ab220075，Abcam）在4°C下培养细胞过夜，然后用DAPI标记核DNA。
标记法根据制造商的方案（Roche Diagnostics），使用TUNEL分析试剂盒评估HUVEC的凋亡水平。用PBS清洗细胞，然后用4%多聚甲醛固定。然后添加含有0.1%Triton X-100的PBS，然后培养2分钟。然后将总计50μl TUNEL溶液添加到样品中，然后在37°C的黑暗中孵育60分钟。使用荧光猝灭溶液密封平板后，在荧光显微镜（OLYMPUS）下观察5个随机场的凋亡细胞。
蛋白质印迹分析在每组处理后，使用RIPA裂解溶液（Sigma-Aldrich）提取总蛋白质，并通过Bradford法测定蛋白质浓度。将总共50µg蛋白质样品加载到每个孔中，并进行SDS-PAGE凝胶电泳以分离目标蛋白质。随后，将蛋白质转移到PVDF膜中。然后在室温下将蛋白带在5%脱脂奶粉中封闭2小时，然后用一级抗体（GRP78，cat.no ab108615，1:1000稀释）孵育。IRE1，分类号ab124945，稀释度1:1000。胱天蛋白酶4，分类号ab25898，稀释度1:1000。切碎，分类号ab11419，稀释1:500。Caspase3，分类号ab32351，稀释度为1:5000。GAPDH，ab8245，1:10000稀释，Abcam）在4°C下过夜，然后与二级抗体（山羊抗鼠IgG，cat.no.ab216772；山羊抗兔IgG（cat.no.ab9705，1:10000）孵育。使用ECL溶液（Pierce™ECL Western Blotting Substrate，ThermoFisher Scientific.Inc）显色后，使用ImageJ 1.42 r（美国国立卫生研究院）分析灰度值。
逆转录定量PCR（RT-qPCR）。分别使用总RNA提取试剂盒和miRNEasy Mini试剂盒（德国QIAGEN）提取待测细胞的总RNA和miRNA。用紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度。以RNA为模板，根据相应逆转录试剂盒（Takara Bio，Inc.）提供的协议，通过逆转录合成cDNA。然后使用该cDNA模板，使用miRNA qRT-PCR SYBR®试剂盒（美国Clontech）进行荧光qPCR检测。为了检测caspase4 mRNA，使用SYBR Green qPCR Master Mix（MedChemExpress）进行PCR定量。PCR循环条件包括94°C预热5分钟，94°C退化35个循环10秒，55°C退火10秒，72°C延伸30秒和72°C延长10分钟。U6或GAPDH被用作内部参照物，miR-381-3p或caspase4 mRNA的相对水平使用2-ΔΔCq方法[21]. 本研究中使用的引物如下：miR-381-3p:Forward，5-TACTTAAGCGAGGTCCTT-3；背面，5ʹ-GGCAGTCTCTGTGAGTA-3 \697]。半胱天冬酶4：正向，5ʹ–CAAGAGAACGTATGGCA-3 \697]；反向，5°–AGGCAGATGGTCAAACTCTGTA-3°。U6前进，5ʹ-CTCCGTCGGCAGCACA-3 \697]；背面，5ʹAACGCTTCACGAATTTGCGT-3 \697]。GAPDH，前进，5ʹ–TGACGTGCCGCCTGGAGAAC−3 \697；反向，5ʹ–CCGGCATCGAAGGTGGAAG−3 \697]。
双荧光素酶报告分析使用在线靶基因预测数据库starBase预测miR-381-3p的靶基因。根据上述气相电泳分子迁移率分析预测的结合位点，设计合成了含有结合位点（wt-casase-4）和突变序列（mut-casase-4.）的质粒。将Wt-caspase-4或mut-caspase-4克隆到荧光素酶报告载体psiCHECK2（中国上海科雷生物科技有限公司）中，构建荧光报告质粒。细胞接受miR-NC和miR-381-3p的联合转染。37°C下48小时后，检测荧光素酶活性。按照双荧光素酶报告试剂盒（中国上海Yeasen）的要求进行具体操作，并记录萤火虫和肾荧光素的荧光素酶活性。
miRNA转染合成miR-381-3p模拟物（50 nM）、抑制剂（50 nM）或阴性对照物，并从上海基因制药有限公司购买。这些miRNA试剂使用Lipofectamine®3000（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）转染到HUVEC中根据制造商的协议，在37°C下放置24小时，随后用于进一步的实验。未转染细胞作为对照组。miR试剂的序列如下：miR-381-3p mimic 5ʹ-UAUACAAGGCAAGCUCUGU-3 \697'，miR-mimic-NC，5 \697；-UAUCCUAUGGCUAAGGAAGUACC-3 \697]。miR-381-3p抑制剂，5ʹAUAUUCCCGUUCGAGACA-3 \697]，miR抑制剂-NC，5DZ–GGACAUGUAAUCCAUGCA-3 \697'
统计分析所有测试都重复至少三次，GraphPad Prism 7。使用0统计软件（GraphPad software，Inc.）分析数据并绘制统计图。实验数据表示为平均值±标准偏差（SD）。采用单向方差分析进行多组间的比较，然后进行Tukey的事后检验。P<0.05被认为表示统计学上的显著差异。
结果
登德罗宾减弱TM对HUVEC的增殖抑制和凋亡诱导作用为了研究石斛碱对HUVEC中ERS的影响，先用不同浓度的石斛素处理细胞，然后用TM处理细胞。我们使用TUDCA抑制ERS，研究发现它是内质网应激抑制剂[18,19]. 如所示，用中等浓度的石斛处理后，观察到细胞活力增加，TUDCA处理的细胞也出现了这种效果(P<0.05,). 当用BrdU染色检测HUVEC的增殖时，仅在中等浓度的石斛中观察到绿色荧光的明显增加，TUDCA处理也观察到这种影响(). 相比之下，TUNEL分析细胞凋亡水平的结果显示，与模型组相比，中等浓度石斛碱处理后的荧光强度显著降低(P<0.001,). 用TUDCA治疗的阳性对照组也观察到类似的效果。这些结果表明，中等浓度的石斛碱处理诱导的增殖和凋亡变化与ERS抑制剂诱导的作用相似。因此，石斛碱在ERS引起的HUVEC中起到保护作用。
石斛碱对HUVEC增殖的影响。（a） 细胞计数试剂盒-8分析结果。（b） BrdU染色评价HUVEC增殖。Dend-L：石斛的低浓度，1µM；Dend-M：石斛的中等浓度，5µM；Dend-H：石斛的高浓度，10µM。人脐静脉内皮细胞；溴脱氧尿苷***P<0.001 Vs控制，$P<0.05 Vs TM+Dend-L，@@P<0.01 VS TM（型号）
石斛碱对细胞凋亡的影响。（a和b）凋亡的TUNEL染色结果***P<0.001 Vs控制###P<0.001 Vs TM（模型），$$$P<0.001 Vs TM+Dend-L，&&&P<0.001 Vs TM+Dend-M，@@@P<0.01 VS TM（型号）
石斛碱对ERS相关蛋白表达的影响为了研究石斛作用的分子机制，主要关注ERS途径。Western blot分析78-kDa葡萄糖调节蛋白（GRP78）、肌醇需要酶1（Ire1）、caspase-4、C/EBP同源蛋白（CHOP）和caspase-3的表达表明，在中等浓度的石斛碱处理后，这些蛋白的表达显著降低(P<0.05）与模型组比较；低浓度石斛处理后，除Ire1外，这些蛋白的表达没有明显改变(). 在ERS条件下，HUVEC表达低水平的miR-381-3p；然而，石斛碱预处理以浓度依赖的方式显著恢复了这些水平(P<0.05). 此外，经TUDCA治疗后，miR-381-3p表达没有明显变化()表明TUDCA和miR-381-3p水平之间没有直接关联；因此，TUDCA可能通过其他途径调节ERS。
石斛治疗后内质网应激相关蛋白水平的评估。GRP78、Ire1、caspase-4、CHOP和caspase3表达的western blot分析结果。GRP78，78-kDa葡萄糖调节蛋白；Ire1，肌醇需要酶1；CHOP，C/EBP同源蛋白***P<0.001 Vs控制#P<0.05 Vs TM（模型），$P<0.05,$$$P<0.001或Vs TM+Dend-L，&P<0.05,&&P<0.01或&&&P<0.001 Vs TM+Dend-M，@@@P<0.01 VS TM（型号）
石斛治疗后miR-381-3p表达的评估。miR-381-3p表达的逆转录定量PCR分析结果。miR，microRNA***P<0.001 Vs控制#P<0.05 Vs TM（模型），$$P<0.01或Vs TM+Dend-L，&&P<0.01 Vs TM+Dend-M，@@@P<0.01 VS TM（型号）
未经ERS处理的HUVEC中未观察到细胞增殖和凋亡的变化为了验证miR-381-3p和caspase-4的靶向关联，进行了双核糖核酸酶报告分析，以确定miR-381-3 p是否与caspase-4mRNA的3 UTR结合。值得注意的是，荧光素酶活性降低(P<0.001）当WT caspase-4和miR-381-3p模拟物共同转染到细胞中并培养48小时(，b）。为了进一步研究miR-381-3p的作用，我们首先检测了miR-381-3p模拟物或抑制剂的转染效果。RT-qPCR结果显示miR-381-3p模拟物或抑制剂显著改变了miR-381-3 p的水平(). 然而，在未被TM攻击的HUVEC中，miR-381-3p并不影响caspase-4的mRNA水平()而它影响caspase-4的蛋白水平(P<0.01,). 此外，转染miR-381-3p模拟物或抑制剂的HUVEC的增殖和凋亡没有明显变化(). 这些结果表明，在没有ERS诱导的情况下，当HUVEC表达基础caspase-4水平时，miR-381-3p不影响细胞增殖或凋亡。
miR-381-3p与caspase-4的3ʹ非翻译区结合。（a） starBase预测的结合位点。（b） 双核糖核酸酶报告子分析结果。miR，micoRNA***P<0.001 Vs WT+Caspase4+NC模拟
miR-381-3p影响caspase-4的蛋白水平。（a） miR-381-3p水平的逆转录定量PCR分析。（b） miR-381-3p模拟物或抑制剂转染后caspase-4 mRNA水平。（c） miR-381-3p模拟物或抑制剂转染后caspase-4的蛋白水平。miR，microRNA***P<0.001相对于miR-381-3p NC，###
P<0.001 Vs miR-381-3p模拟
miR-381-3p模拟物或抑制剂对细胞增殖和凋亡的影响。（a） 细胞计数试剂盒-8对miR-381-3p模拟物或抑制剂转染后细胞增殖的检测结果。（b和c）miR-381-3p模拟物或抑制剂转染后细胞凋亡的TUNEL染色结果。miR，microRNA
miR-381-3介导石斛碱对ERS诱导的HUVEC的影响为了确定miR-381-3p抑制剂是否改变石斛对TM激发的HUVEC的作用，用石斛和miR-381-3抑制剂处理TM诱导的细胞。miR-381-3p过度表达后，经TM处理的HUVEC中上述细胞过程（包括增殖和凋亡）显著改变。值得注意的是，miR-381-3p抑制剂显著逆转了石斛碱对经TM治疗的HUVEC的影响(P<0.05,). 然后进行Western blot分析以检测ERS相关蛋白的表达。在接受ERS治疗的miR-381-3p过度表达的HUVEC中观察到caspase-4表达显著下降；然而，miR-381-3p抑制剂的转染逆转了突树宾对这些水平的影响(P<0.05,). 此外，在其他蛋白质中未观察到miR-381-3p的这些作用。因此，除了miR-381-3p介导的caspase-4相关凋亡参与石斛的作用外，其他ERS通路也参与石斛草的作用机制。
miR-381-3p模拟物或抑制剂对TM诱导后细胞增殖和凋亡的影响。（a） 细胞计数试剂盒-8分析结果。（b和c）通过TUNEL分析评估细胞凋亡。（d） 通过western blot分析检测ERS相关蛋白水平。TM，衣霉素；内质网应激；miR，microRNA***P<0.001 Vs控制，###
P<0.001 Vs TM+miR-381-3p NC，<0.05，$$$P<0.001 Vs TM+Dend-M
讨论
内皮细胞的改变导致AS的不同阶段。最近的研究揭示了内质网应激对内皮功能障碍的影响[22,23]. HUVEC的增殖和凋亡在AS的发病机制中起着至关重要的作用[24,25]. 正常水平的细胞凋亡有利于维持生理稳态。内皮细胞凋亡与AS的发生发展[26]. 除了细胞凋亡外，内皮细胞的焦凋亡或铁凋亡也被报道与动脉粥样硬化的病理机制有关[27,28]. 新的证据表明，石斛具有降血糖作用。在本研究中，TM被用于诱导HUVEC中的ERS，其抑制细胞增殖并诱导凋亡，同时诱导ERS相关蛋白表达。TUCDA是一种ER抑制剂，用作阳性对照组。适当浓度的石斛碱可增强TM暴露的HUVEC的增殖并促进其凋亡，同时GRP78、Ire1、CHOP和caspase-3水平显著降低。据报道，登德罗宾可减少妊娠期糖尿病（GDM）的炎症反应，并对改善GDM、异烟肼和利福平诱导的肝损伤症状产生保护作用[29,30]. 此外，它对非小细胞肺癌有潜在的抗肿瘤作用[16]. 因此，我们预测石斛对癌症和非癌症的影响可能与不同类型细胞环境的分化有关。持续或过度的内质网应激会通过转录因子依赖性和caspase 12依赖性途径诱导细胞凋亡转录。GRP78/IRE1/CHOP轴构成转录因子依赖途径[31,32]. Caspase-4是人类Caspase-12的替代物，是ERS的下游凋亡信号蛋白，是游离Ire1的特异靶点，主要定位于ERS的外膜[33,34]. CHOP是另一种ERS凋亡信号蛋白，不受Ire1直接调节[23,35]. 在本研究中，在非应激条件下，miR-381-3p模拟物或抑制剂对caspase4 mRNA水平没有显著影响，但对caspase 4的蛋白水平有显著影响，这可能是由于caspase的基础水平较低所致。ERs诱导后，HUVEC细胞显示出胱天蛋白酶4的mRNA和蛋白水平显著增加，而miR-381-3p模拟物能够显著降低胱天蛋白酶4的mRNA和蛋白水平。此外，其抑制剂逆转了石斛碱对TM激发的HUVEC中caspase-4水平的影响。
尽管石斛碱对GRP78、Ire1、caspase-3和CHOP表达有显著抑制作用，但在miR-318-3p过度表达后，这些蛋白的表达水平没有显著变化。这表明，除了石斛对miR-381-3p表达的促进作用以抑制caspase-4介导的内皮细胞凋亡外，石斛碱还可能通过其他ERS途径相关的机制促进增殖和抑制凋亡。综上所述，中等浓度的石斛碱通过诱导miR-381-3p表达上调，从而降低caspase-4水平，以减少ERS介导的凋亡，从而帮助细胞对抗TM引起的ERS。
结论
本研究表明，在HUVECs中，dendrobine通过上调miR-381-3p来降低胱天蛋白酶-4的表达，从而减少ERS诱导的细胞凋亡。本研究的结果揭示了石斛碱在TM激发的HUVEC中的作用和机制。因此，本文提供的数据可能为ERS在AS病理中的作用提供了额外的见解。
资金筹措表
本研究获得上海市科学技术委员会医学指导（中医药）科技支撑项目（编号17401933700）、上海市卫生和计划生育委员会科研项目（编号201640039）的批准上海中医药大学高峰高原课题（临床人才专项）（NO.171319）。
数据和材料的可用性
当前研究期间使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。
作者的贡献
JM、Gl Y和Df L对研究的构思和设计做出了重大贡献，获取、分析和解释了数据，起草和修订了重要知识内容的手稿。JM、Gl Y、Xy S、Gl Y、Hh W、Ht L和Df L进行了实验并解释了数据。JM、Gl Y和Df L确认原始数据的真实性。所有作者阅读并批准了最终手稿。
集锦
1.登德罗滨对ERS诱导的人脐静脉内皮细胞增殖抑制和凋亡促进具有保护作用。石斛碱对ERS诱导的细胞损伤的预防作用与miR-381-3p有关。
3.登德罗滨减少雌激素受体引起的细胞凋亡，部分是通过降低caspase4，从而阻断雌激素受体诱导的细胞凋亡。
4.登德罗滨可能是治疗AS的潜在药物。
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