Transl Oncol公司。2021年8月；14(8): 101135.
长非编码RNA LINC01215通过RUNX3启动子甲基化促进上皮性卵巢癌上皮间质转化和淋巴结转移
,a、，1 ,b、，1 ,一 ,一和b、，⁎
刘伟（音译）
一哈尔滨医科大学附属第二医院妇产科，哈尔滨150086
舒坦
b条哈尔滨医科大学肿瘤附属医院妇科肿瘤科，黑龙江省哈尔滨市，150086
白晓旭
一哈尔滨医科大学附属第二医院妇产科，哈尔滨150086
马时红
一哈尔滨医科大学附属第二医院妇产科，哈尔滨150086
陈秀伟
b条哈尔滨医科大学肿瘤附属医院妇科肿瘤科，黑龙江省哈尔滨市，150086
一哈尔滨医科大学第二附属医院妇产科，中国哈尔滨150086
b条哈尔滨医科大学肿瘤附属医院妇科肿瘤科，黑龙江省哈尔滨市150086
1这些作者被视为第一作者。
2021年2月18日收到；2021年4月28日修订；2021年5月19日接受。
这是CC BY-NC-ND许可下的开放存取文章(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
亮点
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该研究首次报道了LINC01215对RUNX3启动子甲基化的调控。
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LINC01215在EOC中高度表达，而RUNX3在EOC是相互的。
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LINC01215过度表达促进RUNX3的甲基化并降低其表达。
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LINC01215静音抑制EOC的LNM和EMT。
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本研究可能为EOC提供新的治疗靶点。
关键词：长非编码RNA LINC01215，Runt-related转录因子3，上皮性卵巢癌，上皮-间质转化，淋巴结转移，侵袭，转移
摘要
上皮性卵巢癌（EOC）仍然是女性最致命的妇科恶性肿瘤，尽管最近在包括手术和化疗在内的管理方面取得了进展。根据基因芯片数据{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE18520”，“term_id”：“18520”}}GSE18520标准和{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE54388”，“term_id”：“54388“}}GSE54388标准数据集，LINC01215被鉴定为EOC中上调的长非编码RNA（lncRNA）。因此，本研究旨在了解LINC01215在EOC进展中的作用。通过RT-qPCR筛选LINC01215表达量最高的EOC细胞株。然后用MS-PCR检测EOC细胞中RUNX3的甲基化。此外，RIP和RNA下拉分析结果揭示了LINC01215与甲基化相关蛋白之间的相互作用。随后，研究了LINC01215和RUNX3在调节EOC细胞生物学行为中的作用。最后，在裸鼠异种移植瘤中评估LINC01215和RUNX3异位表达对EOC细胞肿瘤形成和淋巴结转移（LNM）的影响。过度表达LINC01215导致RUNX3水平下调，甲基化相关蛋白的招募证明了这一点。沉默LINC01215可提高RUNX3的表达，从而抑制细胞增殖、迁移、侵袭和EMT，降低MMP-2、MMP-9和Vimentin的表达，但增加E-cadherin的表达。通过诱导RUNX3.的表达，下调LINC01215.水平可抑制肿瘤生长和LNM。总之，下调的LINC01215可以通过促进RUNX3的甲基化来上调其表达，从而抑制EOC细胞的增殖、迁移和侵袭、EMT、肿瘤生长和LNM。
关键词：长非编码RNA LINC01215，Runt-related转录因子3，上皮性卵巢癌，上皮-间质转化，淋巴结转移，侵袭，转移
引言
卵巢癌是女性最常见的致命癌症，在所有妇科恶性肿瘤中死亡率最高。具体来说，上皮性卵巢癌（EOC）是最常见的五种癌症之一[1,2]. 一些先进的早期检测方法已被用于诊断，长期癌症生存率相对令人满意；然而，在晚期卵巢癌患者中，五年生存率仍为10-30%[3]此外，尽管初级手术和化疗的结果对诊断为早期卵巢癌的患者来说是乐观的，但复发通常发生在晚期患者身上，可用的挽救疗法已被证明是无效的[4]大多数因素都会导致EOC的预后不良和复发，例如缺乏有效的诊断或预后标志物和治疗方案[5]因此，必须确定EOC进展的调控机制，并为EOC治疗开发新的治疗靶点。
长非编码RNA（Long non-coding RNAs，lncRNAs）是一类新的非编码RNA，其长度超过200个核苷酸，没有蛋白质编码潜能，在致癌和癌症转移中起着关键的调节作用[6,7]. 胃癌、肝细胞癌和肾透明细胞癌中已发现lncRNA的异常表达[8],[9],[10]一些研究报告称，EOC中特定lncRNAs过度表达导致预后不良和促进肿瘤转移[11],[12],[13]Runt-related transcription factor 3（RUNX3）是GC的经典抑癌基因，其表达水平的降低与肝细胞癌患者生存率的降低有关[14]与正常组织相比，GC肿瘤组织中RUNX3基因启动子高甲基化率较高[15]促进RUNX3启动子区CpG岛的甲基化被认为可以下调RUNX3的表达[16]此外，高甲基化调节的RUNX3的抑制与II型EOC不满意的临床结果密切相关[17]因此，我们假设LINC01215参与了EOC的进展，尤其是上皮-间充质转化（EMT）和淋巴结转移（LNM），本研究探讨了LINC0121控制RUNX3表达的机制。
材料和方法
道德声明
本研究经哈尔滨医科大学附属第二医院伦理委员会批准（伦理批准文号：SYDW2021-037）后进行。所有实验程序均严格按照美国国家卫生研究院提供的《实验动物护理和使用指南》进行。
细胞培养
卵巢癌细胞株A2780、HO8910、SKOV-3、ES-2和HO8910pm以及正常卵巢细胞IOSE80购自上海苏尔生物技术有限公司（中国上海）。细胞复苏后，将A2780、HO8910、SKOV-3和正常卵巢细胞培养在罗斯维尔公园纪念研究所（RPMI）1640培养基（美国纽约州格兰德岛Gibco）中，培养基中含有10%胎牛血清（FBS、Gibco237°C时。当细胞达到80%且粘附良好时，用0.25%胰蛋白酶分离细胞并以1:3的比例传代。然后收集处于对数生长期的细胞进行后续实验。
细胞分组和转染
选择处于对数生长期的HO8910p细胞进行转染。将细胞分为6组：空白（未经任何处理的细胞）、阴性对照（NC）（用空质粒转染的细胞）、过表达（oe）LINC01215（用LINC01215过表达质粒转染的细胞）、短发夹RNA（sh）LINC01215（用LINC01215干扰质粒转染的细胞）、，shRUNX3（转染RUNX3干扰质粒的细胞）组和oeLINC01215+shRUN93（转染LINC01215过表达质粒和RUNX3-干扰质粒的共同细胞）组。HO8910pm细胞以1×10的密度接种在12孔板中5当细胞达到50-70%的汇合点时，向微孔中添加800μL无血清培养基。接下来，将oeLINC01215、shLINC01215shRUNX3或oeLINC1215+shRUNX3与lipo2000溶液（11668027，Thermo Fisher Scientific）混合，并将混合物添加到12孔板中。培养6小时后，用新的培养基替换培养基。细胞转染48小时后收集。提取RNA和蛋白质含量用于后续实验。
RNA-结合蛋白免疫沉淀（RIP）分析
使用RIP试剂盒（美国马萨诸塞州米利波）检测LINC01215与DNA甲基转移酶1（DNMT1）、DNMT3A和DNMT3B蛋白的结合能力。收集HO8910pm细胞，用预冷却PBS清洗，并丢弃上清液。随后将细胞置于冰浴中，用等体积的放射免疫沉淀（RIPA）裂解缓冲液（P0013B，Beyotime Biotechnology Co.，Shanghai，China）裂解5min，并在4°C（14000 rpm）下离心10min，提取上清液。一部分细胞提取物用作输入控制，另一部分与抗体孵育以进行共沉淀。将50μL重新悬浮在100μL RIP洗涤缓冲液中的珠子与5μg相应抗体在室温下孵育30分钟。以下抗体：兔抗人DNMT1（1:100，ab13537）、兔抗人DN MT3A（1:100、ab2850）和兔抗人DNA MT3B（1:100和ab2851）。以兔抗人IgG（1:100，ab109489）为阴性对照。上述抗体购自Abcam（美国马萨诸塞州剑桥）。将磁珠抗体复合物洗涤，重新悬浮在900μL RIP洗涤缓冲液中，并与100μL细胞裂解物在4°C下孵育过夜。然后将样品放置在磁性底座上，以收集磁性珠蛋白复合物。然后，使用蛋白酶K缓冲液分离样本和输入，提取RNA进行逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）。
RNA下拉分析
根据磁性RNA-蛋白Pull-Down试剂盒（Pierce，Rockford，IL，USA）提供的说明，将1μg生物素标记的RNA与500μL结构缓冲液混合，在95°C下培养2分钟，然后冰封3分钟。添加50μL磁珠悬浮液，并在4°C下培养过夜。上清液以3000 rpm离心3分钟后，将其丢弃。随后，用500μL RIP洗涤缓冲液将沉淀冲洗三次，并在室温下与10μL细胞裂解液孵育1h。用回收的上清液低速离心珠状RNA-蛋白混合物，并用500μL RIP洗涤缓冲液洗涤3次。接下来，使用10μL细胞裂解液上清液作为蛋白质输入。测定蛋白浓度后，进行western blot分析以确定蛋白表达水平。
细胞计数试剂盒-8（CCK-8）分析
应用CCK-8试剂盒（WH1199，上海威尔生物技术有限公司，中国上海）进行细胞增殖检测。将HO8910pm细胞接种在5×10的96周板中三细胞/100μL/孔。培养24、48和72小时后，丢弃上清液，向每个孔中添加10μL CCK-8溶液，然后在37°C下再培养2小时。接下来，使用Multiskan FC微孔板阅读器（51119080，Thermo Fisher Scientific）测量450 nm波长下的光密度（OD）值。增殖率（%）=[（OD对照组-外径实验组)/操作系统对照组] × 100%. 每个孔设置三个重复，并计算平均值。实验重复3次。
划痕试验
用记号笔在6孔板后面绘制井的水平线（间隔：0.8 cm，每个井至少5条线）。将HO8910pm细胞接种在6孔板中，用含有10%FBS和抗生素的3mL培养基替换原始培养基。细胞培养4小时后，在含有血清的完整培养基中进一步培养24小时。使用无菌微移液管尖端（200µL）垂直划伤细胞单层。随后用PBS清洗平板3次，以去除脱落的细胞。最后，在37°C和5%CO的无血清培养基中培养细胞2。图像是在0获取的第个小时和24小时第个用显微镜测定细胞迁移距离。实验重复3次。
Transwell分析
Matrigel（Becton，Dickinson and Company，NJ，USA）用预冷无血清培养基以1:1的比例稀释，并添加到Transwell（美国纽约州康宁市康宁玻璃厂）的顶部腔室中（50µL/well），并在37°C下培养，以将Matrigel聚合成凝胶。各组细胞在含有1%FBS的培养基中去除营养物质24小时，然后收获并重新悬浮在密度为5×10的无血清培养基中6细胞/mL。将100μL细胞悬浮液置于心尖室，同时将含有10%FBS的800μL细胞培养基加入基底外侧室。随后，在37°C和5%CO下培养细胞2持续24小时。然后，用棉签轻轻擦拭迁移失败的细胞，同时用4%多聚甲醛固定迁移的细胞，用结晶紫染色，并浸入水中使其恢复蓝色。在倒置显微镜（×100）下，按照五点取样法随机选择5个视野，对染色的迁移细胞进行拍照和计数。获得平均值，并重复实验3次。
流式细胞术
转染HO8910pm细胞48小时后，用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰蛋白酶将其分离并收集。用预冷PBS洗涤三次后，再次离心细胞，并丢弃上清液。按照Annexin-V-异硫氰酸荧光素（FITC）细胞凋亡试剂盒（C1065，Beyotime Biotechnology Co.，Shanghai，China）的说明，使用Annexin V-FITC、碘化丙啶（PI）和4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液制备比例为1:2:50的AnnexinV-FITC/PI染料。使用100μL Annexin-V-FITC/PI染料重新悬浮1×106细胞，然后振荡和混合。在室温下培养15分钟后，添加另一个1mL HEPES缓冲液并完全混合。最后，在525nm和620nm的激发波长下用流式细胞仪检测细胞凋亡。
RT-qPCR
按照Trizol（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）的指示从细胞中提取总RNA含量。由AuGCT生物技术有限公司（中国北京）设计并合成了LINC01215、RUNX3、基质金属蛋白-2（MMP-2）、MMP-9、E-cadherin和Vimentin的引物（表S1）。然后，在PCR放大器（T100，Bio-Read Laboratories，Shanghai，China）中将RNA反向转录成cDNA。RT-qPCR采用StepOnePlus qPCR仪器（美国纽约州牡蛎湾ABI公司StepOne Plus）和SYBR绿色荧光染料法（中国上海济宁实业有限公司163795-75-3）。U6被用作LINC01215的内部参考，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）被用作其他靶基因的内部参考。使用2计算目标基因的相对表达-ΔΔCt方法[23].
甲基化特异性聚合酶链式反应（MS-PCR）
RUNX3甲基化和非甲基化的引物由AuGCT生物技术有限公司（中国北京）设计和合成（表S2）。用蛋白酶K分离HO8910pm细胞后，用氯仿提取细胞DNA，并用分光光度计测定其浓度。淋巴细胞中的DNA作为阳性对照。上述提取的DNA用亚硫酸氢钠处理，获得硫化DNA。MS-PCR反应体系（25μL）由12.5μL 2×FMSP缓冲液、0.5μL正向引物、0.5μL反向引物、2μL硫化DNA和9.5μL ddH组成2O.反应条件包括在95°C下进行15分钟的预净化，在95°C下进行35次30秒的变性循环，在60°C下退火30秒，在72°C下延伸30秒，最后在72°C下延伸10分钟。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并在紫外光下观察条带。
蛋白质印迹分析
从细胞中提取总蛋白含量，并使用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离。之后，将蛋白质转移到硝化纤维素膜上（LC2005，赛默飞世尔科技公司）。在室温下，将膜在5%脱脂奶粉中封闭2 h，并用三缓冲盐吐温（TBST）清洗3次（每次10 min）。接下来，在4°C的温度下将膜与以下原代兔抗人多克隆抗体孵育过夜：RUNX3（ab92336，1:5000）、MMP-2（ab92536，1:1000）、MMP-9（ab73734，1:1000和GAPDH（ab181602，1:5000）。在室温下用TBST清洗3次（每次5分钟）后，将膜在室温下与辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG（ab97051）孵育1小时。上述抗体均购自Abcam。在室温下用TBST在摇床上进行三次冲洗后，每次5分钟，将膜浸泡在室温下的增强化学发光（ECL）反应溶液（BM101，Biomiga，San Diego，CA，USA）中1分钟。最后，在黑暗中对膜进行X射线照射，以获得最终固定结果。GAPDH被用作内部蛋白质参考，并且靶带的灰度值与内部参考带的灰度值的比率被用作蛋白质的相对表达。
裸鼠异种移植瘤
从中国医学科学院实验动物研究所（中国上海）购买30只特定无致病性（SPF）级雌性裸鼠（BALB/c-nu/nu），年龄4周，体重14-16克。裸鼠被随机分为6组（n=5）：空白、NC、oeLINC01215、shLINC01215,shRUNX3和oeLINC1215+shRUNX3组（分别用空白、NC，oeLINC2115、shLINC1215、shRUN93和oeLINC01215和shRUN/3质粒处理的细胞注射小鼠）。每组裸鼠均注射相应的转染细胞和单细胞悬液（5×107细胞/mL）皮下注射到背部。用游标卡尺测量肿瘤的最大直径（L）和最小直径（W），根据公式计算肿瘤体积：V（mm三)=W2×长×0.52[24]每周测量裸鼠肿瘤体积和重量。35天后，裸鼠在CO后通过颈椎脱位实施安乐死2吸入。然后，在移除异种移植瘤并切除肿瘤组织最大表面且无任何坏死后，将较大部分固定在4%中性甲醛溶液中过夜。肿瘤组织以50μm的间隔用石蜡包埋。最后，连续切片10片，厚度5μm，HE染色。在显微镜引导下记录肿瘤转移总数，并测量肿瘤体积。
苏木精-伊红（HE）染色
裸鼠淋巴组织切片用4%多聚甲醛溶液固定24小时。常规脱水过程用常规梯度乙醇（乙醇浓度70%、80%、90%、95%和100%）进行，每次1分钟。随后用二甲苯清洁组织两次（每次5分钟），浸泡在蜡中，包埋在石蜡中，然后切片为4μm切片（部分切片用于免疫组织化学）。石蜡包埋切片常规在水中脱蜡，用苏木精染色4分钟并清洗。用盐酸和乙醇进行10 s的鉴别。将切片冲洗5分钟，然后将其放回氨溶液中10分钟以恢复到蓝色。用曙红染色切片2分钟，然后梯度乙醇脱水（每次1分钟），用二甲苯清洗2次（每次1分钟）。接下来，用中性口香糖密封载玻片。最后，在光学显微镜（CSW-PH50，深圳市科威光学仪器有限公司，中国深圳）的引导下观察肿瘤组织的病理变化。
统计分析
采用SPSS 21.0（IBM Corp.，Armonk，NY，USA）进行统计分析。测量数据表示为平均值±标准偏差。采用单因素方差分析（ANOVA）对多组数据进行比较，然后进行Tukey事后检验。通过ANOVA的重复测量进行不同时间点的数据比较，然后进行Bonferroni事后检验。在第页 < 0.05.
结果
LINC01215通过招募甲基化蛋白促进RUNX3启动子甲基化
生物信息学分析表明LINC01215位于细胞核中(A） ●●●●。通过RNA下拉和RIP分析，探讨了LINC01215与甲基化相关蛋白DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的关系以及与RUNX3的结合关系。如所示B、 C，LINC01215可以招募DNMT1、DNMT3A和DNMT3B，然后结合到RUNX3的启动子区。此外，通过MS-PCR检测到HO8910pm细胞中RUNX3的高水平甲基化活性(D） ●●●●。这些结果表明，LINC01215可以通过甲基化相关蛋白DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的招募促进RUNX3启动子区的甲基化。
LINC01215通过招募甲基化相关蛋白增强RUNX3启动子甲基化。
注：A组，通过生物信息学方法预测LINC01215位于细胞核中；B和C组，通过RNA下拉RIP分析，LINC01215可以招募DNMT1、DNMT3A和DNMT3B；图D，HO8910p细胞通过MS-PCR分析显示RUNX3的高度甲基化。*，第页< 0.05与。IgG；
LINC01215上调或RUNX3沉默促进EOC细胞增殖
首先，western blot分析证实了shRUNX3-1、shRUNS3-2和shRUNXS-3的沉默效率，如用shRUNB3-1、shRUNX3-2或shRUN003-3处理后细胞中RUNX3表达降低所示。特别是，shRUNX3-2表现出最优越的消声效率，因此被用于后续实验。同时，western blot分析结果也验证了RUNX3过度表达的效率(A） ●●●●。此外，RT-qPCR结果显示成功转染shLINC01215-1、shLINC012.15-2和shLINC01125-3，其中shLINC02125-1具有最佳的沉默效率，因此用于后续实验。RT-qPCR也证实了oeLINC01215的成功转染(B） ●●●●。CCK-8检测结果显示，在第1天，这些组之间的增殖能力没有任何差异。与未经任何处理的细胞相比，经oeLINC01215质粒、shRUNX3质粒、oeLINC1215和shRUNX3质粒处理的细胞在第2天和第3天的增殖能力显著提高；另一方面，shLINC01215组显示出完全相反的结果。在第2天和第3天，相对于同时含有oeLINC01215和shRUNX3质粒的细胞，在用oeLINC1215质粒、shRUNX3质粒或oeLINC21215+oeRUNX3.质粒处理的细胞中观察到增殖能力下降。oeLINC01215质粒与shRUNX3质粒处理的细胞之间的比较显示，增殖变化没有显著差异(C） ●●●●。这些数据表明，过度表达LINC01215或RUNX3沉默可刺激EOC细胞增殖。
LINC01215上调和RUNX3沉默均可促进HO8910pm细胞增殖。
注：图A，通过蛋白质印迹分析证实了shRUNX3-1、shRUNX3-2、shRUNX3-3和oeRUNX3的转染效率；图B，通过RT-qPCR证实的shLINC01215-1、shLINC01215-2、shLINC01215-3和oeLINC01215的转染效率；C组，通过CCK-8分析检测细胞增殖。*，第页< 0.05与。空白组；#,第页< 0.05与。oeLINC01215+shRUNX3处理；NC，阴性对照；oeLINC01215，LINC01215-过表达；shRUNX3，短发夹RNA靶向runt-related转录因子3。数据显示为三个技术复制品的平均值±标准偏差。单因素方差分析用于多组之间的数据比较。
LINC01215过表达或RUNX3沉默诱导EOC细胞迁移和侵袭
分别用划痕试验和Transwell法评价转染后EOC细胞的迁移和侵袭能力。如所示、oeLINC01215、shRUNX3和oeLINC1215+shRUNX3治疗导致细胞迁移距离增加，侵袭性细胞增多(第页<0.05），与未接受任何治疗的细胞形成对比。转染shLINC01215的细胞迁移距离缩短，侵袭性细胞减少(第页<0.05）与转染oeLINC01215和shRUNX3的细胞相比，而oeLINC1215和shRUNX3处理的细胞之间没有明显差异(第页 > 0.05). 然而，与oeLINC01215和shRUNX3处理相比，oELINC1215、shRUNX3或oELINC201215+oeRUNX3处理的细胞迁移距离和侵袭细胞减少(第页 < 0.05). 总之，过度表达LINC01215和沉默RUNX3可能有助于EOC细胞迁移和侵袭。
LINC01215过度表达或RUNX3沉默均可诱导HO8910pm细胞迁移和侵袭。
注：A组，划痕试验测定的细胞迁移能力（40×）；B组，各组细胞迁移距离；C组，根据Transwell分析结果的细胞侵袭能力（200×）；D组，每组侵袭细胞的数量；*，第页< 0.05与。空白组；#,第页< 0.05与。oeLINC01215+shRUNX3联合处理；NC，阴性对照；oeLINC01215，LINC01215-过表达；shRUNX3，靶向runt相关转录因子3的短发夹RNA。数据显示为三个技术重复的平均值±标准差。单因素方差分析用于多组之间的数据比较。
上调LINC01215或下调RUNX3抑制EOC细胞凋亡
流式细胞术检测LINC01215和RUNX3对EOC细胞凋亡率的调节作用。首先，Annexin V-FITC/PI双重染色结果(A和B）表明，与不治疗相比，oeLINC01215、shRUNX3和oeLINC1215+shRUNX3治疗可显著降低EOC中的细胞凋亡率(第页 < 0.05). 然而，我们发现shLINC01215处理的细胞凋亡率低于oeLINC01215和shRUNX3处理的细胞(第页<0.05），而oeLINC01215治疗和shRUNX3治疗之间的差异不明显(第页 > 0.05). 与oeLINC01215和shRUNX3的联合治疗相比，oeLINC1215、shRUNX3或oeLINC201215+oeRUNX3.治疗后细胞凋亡率较高。因此，可以得出结论：上调LINC01215或下调RUNX3抑制EOC细胞的凋亡率。
通过流式细胞术检测LINC01215上调或RUNX3下调可抑制HO8910pm细胞凋亡。
注：面板A，散点图中的HO8910pm单元；B组，各组细胞凋亡率；*，第页<0.05与。空白组；#,第页< 0.05与。oeLINC01215+shRUNX3联合处理；NC，阴性对照；oeLINC01215，LINC01215-过表达；shRUNX3，短发夹RNA靶向runt-related转录因子3。数据显示为三个技术复制品的平均值±标准偏差。单因素方差分析用于多组之间的数据比较。
LINC01215沉默通过上调RUNX3抑制EMT
RT-qPCR和western blot分析检测E-cadherin、MMP-2、MMP-9和Vimentin的以下表达，均为EMT相关标记物。如中所示与未接受治疗的细胞相比，A–C、RUNX3缺失和/或LINC01215过度表达显著抑制了RUNX3和Vimentin的表达，但促进了细胞中LINC01215,MMP-2，MMP-9和Vimentin4的以下表达，而在接受shLINC01215.治疗的细胞中观察到相反的结果。oeLINC01215、shRUNX3或oeLINC1215+oeRUNX3的治疗降低了LINC01215+MMP-2、MMP-9和Vimentin的表达(第页<0.05），但相对于oeLINC01215+shRUNX3治疗，RUNX3和Vimentin的表达增加(第页 < 0.05). LINC01215、RUNX3或EMT相关标记物的mRNA和蛋白表达无显著差异(第页>0.05）与oeLINC01215处理的细胞和shRUNX3处理的细胞相比。总之，目前的研究结果证实，EMT的抑制可以通过LINC01215沉默来实现，LINC01215沉默上调了RUNX3的表达。
HO8910p细胞的EMT受到LINC01215沉默和RUNX3上调的抑制。
注：A组采用RT-qPCR检测LINC01215、RUNX3和EMT相关基因（MMP-2、MMP-9、E-cadherin和Vimentin）的相对表达；B和C组，通过western blot分析获得RUNX3和EMT相关基因（MMP-2、MMP-9、E-cadherin和Vimentin）的相对蛋白表达；*，第页< 0.05与。空白组；#,第页< 0.05与。oeLINC01215+shRUNX3联合处理；NC，阴性对照；RUNX3，runt-related转录因子3；上皮-间充质转化；RT-qPCR，逆转录定量聚合酶链反应。数据显示为三个技术复制品的平均值±标准偏差。单因素方差分析用于多组之间的数据比较。
LINC01215通过下调RUNX3促进裸鼠肿瘤生长和LNM
为了验证LINC01215和RUNX3对肿瘤生长和LNM的作用，在裸鼠体内建立异种移植瘤，每周监测肿瘤体积。5周后，从裸鼠中提取异种移植物肿瘤，随后用于HE染色(). 接种转染oeLINC01215和shRUNX3质粒的细胞后，小鼠的肿瘤生长加快，肿瘤体积增大，肿瘤转移增加，而shLINC01216治疗结果相反。从oeLINC01215和shRUNX3联合治疗的小鼠身上提取的肿瘤显示出最快的生长速度、最大的肿瘤体积和最大的肿瘤转移数量（全部第页 < 0.05). 淋巴组织HE染色结果显示，oeLINC01215和shRUNX3产生了大量转移性肿瘤细胞，这表明LNM的促进作用(第页<0.05），而抑制LNM显示shLINC01215组没有转移肿瘤细胞。oeLINC01215+shRUNX3治疗诱导了最多数量的肿瘤细胞转移到淋巴结(第页 < 0.05). 结果表明，LINC01215的过度表达可以增强肿瘤生长和LNM，从而降低RUNX3。
LINC01215过表达通过RUNX3下调促进裸鼠肿瘤生长和LNM。
注：A组，裸鼠移植瘤的肿瘤生长情况；B组，各组小鼠肿瘤转移数的定量分析；C组，小鼠淋巴组织切片HE染色（200×）；D组，各组小鼠第1、2、3、4周肿瘤体积；*，第页< 0.05与。空白组；NC，阴性对照；RUNX3，runt-related转录因子3；淋巴结转移；HE，苏木精-伊红。数据显示为三个技术复制品的平均值±标准偏差。采用重复的方差分析方法分析不同时间点的数据(n个 = 5).
讨论
EOC是一种对女性构成严重威胁的恶性肿瘤，晚期诊断患者的5年生存率通常低于30%[25]随着越来越多的研究关注lncRNAs在各种癌症中的功能，越来越多的lncRNA被确定在EOC的发展中发挥关键作用。在本研究中，我们试图找出LINC01215影响EOC进展的机制。我们证明LINC01215在EOC细胞中高度表达，并通过诱导RUNX3启动子甲基化促进侵袭性、迁移性、增殖性、EMT、LNM和肿瘤生长，同时抑制EOC细胞凋亡。
最初，我们的结果显示，在EOC细胞中LINC01215的表达显著增加。LINC01215具有招募甲基化相关蛋白DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的能力，从而促进RUNX3启动子的甲基化。RUNX3在可能致癌或抑癌功能方面存在争议[26]RUNX3的超甲基化与II型EOC进展之间的关联已由一项研究证实[17]我们的研究表明，沉默LINC01215抑制细胞迁移、侵袭和增殖能力，同时通过恢复RUNX3启动子甲基化加速EOC的凋亡。此外，RUNX3表达的缺失可能有助于抑制肝癌细胞凋亡，从而诱导肿瘤发生[27].
此外，通过RT-qPCR和western blot分析，MMP-2、MMP-9和Vimentin的miRNA和蛋白表达的增加以及E-cadherin的减少表明EOC中的EMT是由LINC01215过度表达或RUNX3缺失引起的。EMT是一个生物过程，涉及增强迁移和侵袭能力、减少凋亡以及增加细胞外基质成分[27]也是细胞迁移和侵袭能力的重要机制[28]有一项研究强调了E-钙粘蛋白强制表达在卵巢特异性转移中的意义[29]在EOC的EMT过程中，E-cadherin的表达缺失有助于与内皮和基质成分的相互作用[30]在经历EMT过程的细胞中普遍观察到波形蛋白上调，因为它促进EMT，从而加重肿瘤恶性程度[31]MMP和EMT之间的关系之前已经讨论过，MMPs诱导的表型和基因型改变可能有助于肿瘤进展[32]MMP-9上调与卵巢癌患者不良预后之间的关系已被阐明，提示MMP-9的抑制可能在卵巢癌中具有重要意义[33].体内通过裸鼠移植瘤实验，阐明LINC01215沉默对肿瘤生长和LNM的抑制作用。
结论
总之，我们的研究结果有助于证明LINC01215有助于EOC的进展，并且LINC0121的沉默可能为EOC的治疗提供新的治疗见解。LINC01215过表达触发的RUNX3甲基化可以通过沉默LINC01215来逆转，从而有助于抑制EOC的侵袭、迁移、增殖能力、EMT、LNM和肿瘤生长(). 然而，需要进一步研究来探讨LINC01215与肿瘤发生、转移和预后的关系，并揭示LINC01215.的潜在临床价值。
显示LINC01215通过促进RUNX3甲基化参与EOC进展的分子机制的图表。在EOC细胞中高度表达的LINC01215与RUNX3的启动子区结合，并招募DNMT1、DNMT3A和DNMT3B蛋白来抑制RUNX3的转录，进一步上调MMP-2、MMP-9和Vimentin的表达，下调E-cadherin的表达从而促进EOC细胞的增殖和EMT。上皮性卵巢癌；RUNX3，runt-related转录因子3；DNMT1，DNA甲基转移酶1；DNMT3A、DNA甲基转移酶3A；DNMT3B、DNA甲基转移酶3B；基质金属蛋白酶-2；基质金属蛋白酶-9；基质金属蛋白-9；EMT，上皮-间充质转化。
作者贡献
L-W、T-S、B-XX、M-SH和C-XW设计了这项研究。L-W和T-S整理了数据，进行了数据分析，并制作了手稿的初稿。B-XX、M-SH和C-XW参与了手稿的起草。所有作者都已阅读并批准了最终提交的手稿。
致谢
基金
本研究得到黑龙江省科技厅项目（GC09C406-5）和国家自然科学基金（No.81772274）的资助。
工具书类
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