miR-181d/RBP2/NF-κB p65反馈调节促进慢性髓系白血病爆发危机
，1，† ，1，† ，2 ，1 ，2 ，1 ，1 ，三 ，1 ，2和1，*
郑立新
2山东大学基础医学院微生物学系/教育部实验致畸学重点实验室，济南
王悦（Yue Wang）
2山东大学基础医学院微生物学系/教育部实验致畸学重点实验室，济南
贾继辉
2山东大学基础医学院微生物学系/教育部实验致畸学重点实验室，济南
1山东大学齐鲁医院血液科，济南
2山东大学基础医学院微生物学系/教育部实验致畸学重点实验室，济南
三山东大学齐鲁医院儿科，济南
编辑：Chung Hoow Kok，澳大利亚阿德莱德大学
审核人：澳大利亚阿德莱德大学Ka Chun Cheung；冈晓，浙江大学，中国
†这些作者对这部作品做出了同等贡献，并分享了第一作者身份
这篇文章被提交给《肿瘤前沿》杂志的血液系统恶性肿瘤部分
2021年1月16日收到；2021年3月1日验收。
版权©2021周、尹、郑、付、王、崔、高、王、黄、贾和陈 这是一篇根据知识共享署名许可证（CC BY）条款发布的开放存取文章。允许在其他论坛上使用、分发或复制，但前提是原创作者和版权所有人得到了认可，并且根据公认的学术惯例引用了本期刊中的原始出版物。不允许使用、分发或复制不符合这些条款的内容。
- 补充资料
GUID:D9B7F0D3-B9D5-4B5E-A81A-1D40792FA7FD
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本文中包含了研究中提出的原始贡献/
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。可向相应作者进行进一步查询。
摘要
背景
慢性粒细胞白血病（CML）是一种恶性克隆性增殖性疾病。一旦进入爆炸危机阶段（CML-BP），疗效较差，病死率极高。因此，迫切需要探索冲击波危象的分子机制，寻找新的治疗靶点。
方法
检测42例新诊断的CML-CP患者和15例CML-BP患者miR-181d、RBP2和NF-κB p65的表达水平。定量实时PCR、Western blots和细胞增殖试验用于表征miR-181d、RBP2或p65过度表达或抑制引起的变化。通过荧光素酶报告子分析和ChIP分析建立miR-181d、RBP2和p65之间的功能关联。miR-181d表达的抑制及其在肿瘤生长中的后果已得到证实体内模型。
结果
我们发现，miR-181d在CML-BP中过度表达，从而促进白血病细胞增殖。组蛋白去甲基化酶RBP2被鉴定为下调RBP2表达的miR-181d的直接靶标。此外，RBP2通过结合其启动子和去甲基化p65启动子位点中的三/二甲基化H3K4区域来抑制NF-κB亚单位p65的转录表达。反过来，p65直接与miR-181d启动子结合并上调其表达。因此，miR-181d过度表达导致的RBP2抑制导致p65上调，从而进一步促进miR-181 d的表达。这种miR-181d/RBP2/p65反馈调节导致持续的NF-κB激活，这有助于CML-BP的发展。
结论
综上所述，miR-181d/RBP2/p65反馈调节促进CML-BP和miR-181d可能是CML-BP的潜在治疗靶点。
关键词：miR-181d，RBP2，p65，CML急变，细胞增殖
介绍
慢性粒细胞白血病（CML）是一种起源于造血干细胞的恶性骨髓增生性疾病，其特征是BCR-ABL1型融合基因(1). 该病的自然病程包括慢性期（CP）、加速期（AP）和爆发期（BP）。在慢性粒细胞白血病（CML-CP）的慢性期，白血病细胞仍保持一定的分化为成熟细胞的能力；而在CML（CML-BP）的爆发期，大量侵袭性原始和未成熟细胞积聚(2). 目前，CML-CP患者对酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）有良好的反应，并且大多数患者能长期存活。然而，一些患者仍然对TKI不敏感或产生耐药性，导致加速期和/或爆发期。一旦发展为CML-BP，疗效较差，病死率极高。此外，CML恶性转化的病因复杂且高度异质(三). 因此，迫切需要揭示慢性粒细胞白血病-BP的潜在机制。
表观遗传学意味着基因表达经历了可遗传的变化，而DNA序列没有改变(4). 表观遗传修饰包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA调节，它们影响细胞增殖、分化和凋亡(5，6). MicroRNAs（miRNAs）是一类小的非编码RNA，通过直接与靶基因的3′非翻译区（3′UTR）mRNAs结合，对基因表达进行负调控或正调控(7). 他们也是白血病发展过程中的重要参与者。最近的一项研究表明，miR-150的表达在CML慢性期和急变期之间的过渡期下调(8). 此外，miR-328在CML急变期丢失表达，其过表达可通过诱导生存因子PIM1和抑制翻译调节蛋白多聚（rC）结合蛋白hnRNP E2与CEBPA的结合，促进细胞分化和抑制细胞增殖(9). 此外，与细胞周期调节基因E2F1形成反馈环的miR-223在急性髓细胞白血病（AML）中被发现表达不足(10). MiR-29在KIT相关AML中下调。miR-29和SP1/NF-κB/HDAC相互调节形成反馈调节网络，介导KIT相关AML的发病机制(11). MiR-181家族在AML中过度表达，通过抑制PRKCD、CTDSPL和CAMKK1的表达阻止细胞分化(12). 然而，miR-181d失调是否参与CML进展尚不清楚。
组蛋白修饰酶（包括甲基转移酶和去甲基酶）的失调调节介导肿瘤发生。最近的研究发现，组蛋白甲基转移酶参与了慢性粒细胞白血病急变的发病机制。例如，视网膜母细胞瘤相关锌指蛋白1（RIZ1），一种H3K9组蛋白甲基转移酶，在CML-BP中下调。RIZ1过表达可通过抑制IGF-1信号通路抑制细胞增殖、诱导凋亡和促进分化(13，14). 在CML进展过程中，属于多梳组蛋白的BMI1的表达逐渐增加，这使得该蛋白成为CML-BP的有效标记物(15). 我们发现组蛋白去甲基化酶RBP2通过miR-21的负调控介导CML的爆发危机(16). 然而，RBP2在CML-BP中表达不足的机制尚未研究。
核因子κB（NF-κB）家族通过调节细胞增殖和凋亡在CML进展中起着重要作用，并且在白血病原代细胞中存在NFκB/TNF-α反馈环，促进白血病进展(17). NF-κB信号通路抑制剂PS-1145和AS602868显著诱导CML原代细胞凋亡(18，19). Parthenolide抑制NF-κB转录，极大地促进白血病细胞在爆发危机期的凋亡(20). 此外，最近的研究表明，NF-κB与组蛋白修饰酶之间存在相互作用，这些酶参与炎症和肿瘤的发展，如JMJD3、FBXL11和JMJD2B(21–23). 然而，RBP2是否能调节NF-κB的表达，目前尚不清楚。
在本研究中，我们旨在确定miR-181d是否可以通过miR-181d/RBP2/NF-κB p65反馈环介导CML进展。在CML中，miR-181d过度表达抑制了RBP2的表达，导致p65过度表达。此外，高p65表达反向上调成熟miR-181d的水平，形成反馈回路，促进CML爆发危机的转变。
方法
患者和骨髓样本
患者的骨髓样本于2010年7月至2018年6月在中国济南山东大学齐鲁医院血液科采集。患者为新诊断的CML-CP（n=42）和CML-BP（n=15）。通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从样品中分离出单核细胞，并将其保存在-80°C下。该研究得到山东大学齐鲁医院伦理委员会的批准，并符合1975年《赫尔辛基宣言》（1983年修订）。
细胞系与细胞培养
人类细胞系K562、HL60和HEK-293在37°C、95%空气和5%CO2条件下在含有10%热灭活胎牛血清（FBS；Gibco，Carlsbad，CA，USA）且不含抗生素的RPMI 1640或RPMI DMEM中培养。实验开始前，将细胞在6、12和24孔板上培养18至24小时。
转染
使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）并根据制造商的协议，将MiR-181d模拟物（miR10002821-1-5）/抑制剂（miR200028211-5；中国广州Ribobio）和p65 siRNA（SASI_Hs01_00171095；美国Sigma-Aldrich）转染到细胞中。使用罗氏转染试剂（瑞士罗氏）转染含有RBP2野生型、RBP2-突变型（脱甲基酶活性缺陷RBP2 H483A，Addgene）、p65（实验室所有）和对照质粒（实验室拥有）的质粒。
RNA提取和qRT-PCR
使用Trizol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）从人骨髓样品和不同处理的细胞中提取总RNA。随后，使用PrimeScript RT试剂盒，使用gDNA橡皮擦（日本高原市）对提取的RNA进行逆转录。然后对这些cDNA进行基于SYBR Green的实时PCR分析。RBP2和p65 mRNA水平与人类β-肌动蛋白水平一致。成熟miR-181d的水平归一化为U6的水平。使用的RBP2探针为Hs00231908_m1（应用生物系统）。miR-181d和U6的引物为MQP-0101和MQP-0201（Ribobio）。qRT-PCR分析中使用的其他引物列于表达式由2计算-ΔΔCt方法。
表1
| 底漆 | 序列 |
|---|
| 第65页 | 福沃德 | ATGTGGAGATCATTGAGC公司 |
| 反向 | CCTGGTCCTGTGTAGCCATT公司 |
| β-肌动蛋白 | 福沃德 | AGTTGCGTTACACCTCTTCTTG公司 |
| 反向 | CACCTTCCGTTCCAGTTTT公司 |
| 第65页-ChIP | 福沃德 | TGCAATGGTACATGGGTT公司 |
| 反向 | GTGGCTGCCTCTGATAA公司 |
| miR-181d-ChIP | 福沃德 | ATGGAGTGAGAAGGGCTGC公司 |
| 反向 | TGGGTCAGACAGGAGAG公司 |
Western Blot分析
使用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液提取总蛋白，并进行定量测定。用SDS-PAGE凝胶分离蛋白质，转移到PVDF膜（Millipore，Bedford，MA），并在4°C下用针对RBP2（1:1000，Abcam，ab70892），p65（1:5000，Abcan，ab32536）和β-肌动蛋白（1:10000，Sigma，A5441）的特异性一级抗体隔夜探测然后用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔/鼠IgG（1:6000，Abcam）孵育1小时。随后，使用ECL检测试剂（Millipore）并根据标准方案对免疫印迹进行检测。
免疫染色
从患者骨髓样本中分离出的单核细胞被用于制备带有玻片的胞质钉，玻片由聚甲醛固定液固定。样品在4°C下用抗RBP2抗体（1:150，Abcam，ab78322）和抗p65抗体（1:150%，Abcam，ab32536）染色过夜，然后用辣根过氧化物酶结合二级抗体孵育30分钟。
免疫组织化学
石蜡包埋的载玻片进行脱蜡、再水化，并使用柠檬酸缓冲液进行抗原回收。过氧化氢使内源性过氧化物酶失活。用10%的山羊血清溶液封闭载玻片，并在4°C下与相应的一级抗体孵育过夜。使用的抗体为：抗RBP2抗体（1:150，Abcam，ab78322）、抗p65抗体（1:150%，Abcam，ab32536）和抗Ki67抗体（1:100，Abcan，ab15580）。接下来，将载玻片与二级抗体孵育，然后使用DAB染色试剂盒进行比色检测（Vector Laboratories，USA）。
细胞增殖试验
采用5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EDU）法检测K562和HL60细胞的增殖率。处理后的细胞在荧光检测前与EDU孵育2小时。然后，将细胞涂在玻璃载玻片上，用4%多聚甲醛固定30分钟，然后使用Cell-Light™EDU Apollo进行染色®488体外成像试剂盒（RioBio，中国），并遵循制造商的说明。通过共聚焦激光扫描显微镜检查载玻片。
染色质免疫沉淀（ChIP）分析
对于ChIP分析，使用细胞信号ChIP分析协议。用RBP2抗体（Abcam，ab70892）和二甲基和三甲基H3K4抗体（Abcam，ab32356和ab8580）免疫沉淀的染色质片段纯化DNA，并用于PCR扩增。用PCR检测沉淀的DNA样品。p65和miR-181d启动子的PCR引物列于.
荧光素酶报告分析
将MiR-181d模拟物/抑制剂（中国广州Ribobio）、RBP2野生型/突变型3′UTR和内对照载体TK质粒转染HL60和HEK-293细胞。将含有RBP2野生型、RBP2-突变（脱甲基酶活性缺陷，RBP2 H483A）、p65启动子野生型或结合位点突变质粒和内控载体TK质粒的质粒转染HL60和HEK-293细胞。将p65表达质粒/siRNA、miR-181d启动子野生型或结合位点突变质粒和内对照载体TK质粒转染HL60和HEK-293细胞。孵育24或48小时后，使用荧光素酶测定系统（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）并根据制造商的方案测量荧光素酶活性。为荧光素酶分析克隆的每个启动子区域的准确序列显示在
补充材料
.
肿瘤异种移植模型
对于异种移植模型，6只NOD/SCID雄性小鼠（中国北京华富康生物技术有限公司）接受2Gy剂量的辐射治疗。24小时后，1×106将K562细胞皮下注射到小鼠左右两侧。每3天监测肿瘤生长。从第7天起，每3天向肿瘤内注射miR-181d安塔戈米尔（miR30002821-4-5）或对照。整个过程持续了16天。所有动物程序均经山东大学齐鲁医院研究伦理委员会批准。动物研究也符合ARRIVE指南(24).
统计分析
所有实验至少重复三次。数据表示为平均值±标准差。使用GraphPad Prism for Windows 5.00版（GraphPad-Software，美国加利福尼亚州拉荷亚市），使用Student的t检验比较两组的平均值。p值<0.05被认为具有统计学意义。
结果
miR-181d在CML-BP中过度表达并促进白血病细胞增殖
为了检测miR-181d在CML进展中是否至关重要，我们测量了新诊断的CML-CP患者（n=42）和CML-BP患者（n=15）骨髓样本中成熟miR-181 d的表达水平。这些患者的相关临床特征如所示CML-BP样本中成熟miR-181d水平高于CML-CP样本(). 因此，miR-181d在慢性粒细胞白血病进展过程中过度表达。此外，我们通过将miR-181d模拟物或抑制剂转染K562和HL60细胞，探讨了miR-181 d在白血病细胞增殖中的潜在作用。与NC mimics转染相比，转染miR-181d mimics的细胞增殖速度更快，而转染miR-181d抑制剂的细胞增殖速率较慢().
表2
| 特性 | CML-CP患者（n=42） | CML-BP患者（n=15） |
|---|
| 性别 | 男性 | 23 | 9 |
| 女性 | 19 | 6 |
| 年龄（岁） | 中值的 | 46 | 42 |
| 范围 | 21-75 | 19-68 |
| WBC，×109/L（左） | 中值的 | 202.34 | 125.18 |
| 范围 | 10.34-441.60 | 2.15-414.46 |
| 血红蛋白，g/L | 中值的 | 100.38 | 82.8 |
| 范围 | 48-147 | 45-136 |
| 血小板计数，×109/L（左） | 中值的 | 469.96 | 59.70 |
| 范围 | 134-1486 | 10-210 |
miR-181d在CML-BP中过度表达并促进白血病细胞增殖。（A）CML-CP和CML-BP患者成熟miR-181d的qRT-PCR分析。人CML-CP和BP细胞取自患者骨髓。（B、C）miR-181d模拟物或抑制剂转染K562和HL60细胞后的EDU。结果得到了3个独立实验的证实*第页< 0.05, **第页< 0.01.
miR-181d直接抑制RBP2的表达
为了研究miR-181d促进细胞增殖的机制，我们通过调节miR-181 d的表达水平来研究miR-181d在调节RBP2表达中的潜在作用通过将miR-181d模拟物或抑制剂转染K562和HL60细胞(
补充图1
). 与对照细胞相比，过度表达miR-181d的K562和HL60细胞中RBP2 mRNA和蛋白水平显著降低(，
补充图2
). 另一方面，miR-181d在K562和HL60细胞中的抑制作用导致RBP2增加了mRNA和蛋白质水平(，
补充图2
). 使用靶点预测程序miRanda和TargetScan，我们发现RBP2 mRNA的3′UTR包含一个保守的miR-181d结合位点(). 为了验证这一发现，在荧光素酶开放阅读框下游克隆了含有推测miR-181d结合位点的RBP2 3′UTR及其突变体3′UTRs（带有突变的miR-181d结合位点）。这些荧光素酶报告体与miR-181d模拟物或抑制剂共同转染HL60和HEK-293细胞。miR-181d模拟物转染抑制了RBP2 3′UTR的荧光素酶活性，当miR-181 d结合位点突变时，这种抑制被消除。相反，miR-181d抑制剂上调了RBP2 3′UTR的荧光素酶活性，当miR-181 d结合位点突变时，这种上调也被消除(). 这些数据表明RBP2是miR-181d的直接靶点。
miR-181d直接调节RBP2的表达。（A、B）miR-181d模拟物或抑制剂转染后RBP2 mRNA和蛋白水平的qRT-PCR和Western blot分析。（C）RBP2 3′-UTR中预测的miR-181d结合位点示意图。（D–G）miR-181d模拟/抑制剂转染HL60和HEK-293细胞后RBP2野生型3′UTR及其突变活性。在48小时时测定荧光素酶活性，并用Renilla荧光素酶活性进行标准化。结果来自3个独立的实验*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页<0.001，ns，无统计学意义。
RBP2以组蛋白脱甲基酶依赖方式直接抑制p65转录表达
一些研究表明，p65在促进细胞增殖中起着关键作用，我们之前的研究证实RBP2介导CML爆发危机。然而，p65是否参与了这一发病机制尚不清楚。通过将RBP2野生型或RBP2-突变（脱甲基酶活性缺陷，RBP2 H483A）质粒或对照质粒转染到K562和HL60细胞中，我们比较了不同处理细胞中p65的表达。我们发现RBP2过度表达，显著下调p65 mRNA和蛋白水平(，
补充图3
). 然而，RBP2 H483A质粒也过度表达RBP2但没有脱甲基酶活性，不能抑制p65的表达(，
补充图3
). 这些结果表明，RBP2负调节p65的表达，这取决于其酶活性。
p65被RBP2直接表观下调。（A、B）用RBP2野生型或RBP2-突变（脱甲基酶活性缺陷，RBP2 H483A）质粒转染K562和HL60细胞后RBP2和p65 mRNA水平的qRT-PCR。（C）用RBP2野生型或RBP2 H483A质粒转染K562和HL60细胞后RBP2和p65蛋白表达水平的Western blot分析。（D）p65启动子中预测的RBP2结合位点的示意图。（E、F）RBP2对p65野生型启动子的调节，包括第一个RBP2结合位点（p65-pro1）和第二个RBP2结合位点（p65-pro2）。用p65野生型报告子和RBP2表达质粒转染HL60和HEK-293细胞，然后在转染48小时后进行荧光素酶活性评估。（G、H）p65野生型pro1及其在RBP2野生型质粒转染HL60和HEK-293细胞后的突变活性。（I，J）K562和HL60细胞中RBP2与p65启动子结合的ChIP检测。（K，L）RBP2质粒转染K562和HL60细胞后，RBP2和H3K4me3/2与p65启动子的结合。结果来自3个独立的实验*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页<0.001，ns，无统计学意义。
此外，为了确定p65是否是RBP2的直接靶标，我们在p65的启动子中鉴定了两个潜在的RBP2结合位点(). 我们生成了两个p65启动子质粒，包括第一个RBP2结合位点（p65-pro1）和第二个RBP2-结合位点（p65-pro2），并用RBP2质粒共同转染HL60和HEK-293细胞。RBP2在HL60和HEK-293细胞中过度表达后，p65 pro1启动子活性显著降低，而p65 pro2启动子活性没有明显变化(). 此外，在HL60和HEK-293细胞中RBP2过度表达后，伴随着p65 pro1结合位点的突变，p65 pro1-mut的启动子活性保持不变(). 为了确定RBP2和p65启动子之间的关联，进行了染色质免疫沉淀分析，结果表明RBP2结合到K562和HL60细胞中p65启动程序的启动子区域(). 此外，RBP2过度表达表明其与p65启动子的剂量依赖性关联(). 与组蛋白3上三甲基化和二甲基化赖氨酸4特有的去甲基化酶活性一致，RBP2过度表达也显著降低p65启动子区H3K4三/二甲基化(). 因此，结果表明RBP2通过与p65启动子区的结合减少H3K4三/二甲基化，从而负调控其表达。
p65在CML-BP促进白血病细胞增殖中的异位表达
为了确定p65是否是CML进展的关键因素，我们测量了CML-CP和CML-BP患者骨髓样本中p65的表达。与CML-CP样本相比，CML-BP样本中p65 mRNA和蛋白水平显著升高().
p65在CML-BP中过度表达并促进白血病细胞增殖。（A、B）CML-CP和CML-BP患者骨髓样本p65 mRNA和蛋白水平的qRT-PCR和免疫染色分析。（C，D）用p65质粒或siRNA转染K562和HL60细胞后的EDU。结果由3个独立实验证实*第页< 0.05, **第页< 0.01.
此外，为了探讨p65在CML进展中的潜在作用，将p65质粒或siRNA转染到K562和HL60细胞。与对照质粒相比，转染p65质粒的细胞增殖速度更快；而转染p65 siRNA的细胞增殖速度较低(). 这些数据表明，CML-BP细胞中异位p65表达增强了白血病细胞的增殖。
p65直接上调miR-181d的表达
值得一提的是，我们发现miR-181d受到p65的正向调节(，
补充图4
). 为了探索这一机制，我们发现miR-181d启动子中有两个经典的p65结合位点(). 为了研究miR-181d是否是p65的直接靶点，构建了荧光素酶报告子质粒，该质粒分别包含两个潜在的结合位点（miR-181d-pro1和pro2）。p65的过度表达显著增加了miR-181d pro1的荧光素酶活性；而p65 siRNA显著抑制miR-181d pro1荧光素酶活性(). 然而，p65质粒和siRNA并不影响miR-181d pro2的荧光素酶活性(). 此外，我们构建了miR-181d pro1（miR-181d-pro1-mut）的突变荧光素酶报告子，并观察到当p65过度表达或抑制时，miR-181dpro1-mut的启动子活性没有变化(). 此外，为了探讨p65与miR-181d启动子之间的关系，我们应用了一系列ChIP分析，发现p65在K562和HL60细胞中与miR-81d启动子区域结合(). 综合以上结果，p65直接靶向miR-181d，形成正反馈回路，促进CML爆发危机的转变。
miR-181d被p65直接上调。（A、B）用p65质粒或siRNA转染K562和HL60细胞后，对p65 mRNA和成熟miR-181d水平进行qRT-PCR。（C）用p65质粒或siRNA转染K562和HL60细胞后p65蛋白表达水平的Western blot分析。（D）miR-181d启动子中预测的p65结合位点的示意图。（东-西）p65对miR-181d野生型启动子的调节，包括第一个p65结合位点（miR-181d-pro1）和第二个p65连接位点（miR-181d-pro2）。用miR-181d野生型报告子和p65质粒/siRNA转染HL60和HEK-293细胞，并在转染后48小时或72小时评估荧光素酶活性。（I–L）p65质粒或siRNA转染HL60和HEK-293细胞后，miR-181d野生型pro1及其突变形式的活性。（男，女）K562和HL60细胞中p65与miR-181d启动子结合的ChIP检测。结果来自3个独立的实验*P（P）< 0.05, **第页< 0.01, ***第页<0.001，ns，无统计学意义。
miR-181d抑制抑制白血病细胞增殖在体内
我们进一步研究了miR-181d在慢性粒细胞白血病爆发危机中的致癌作用体内当肿瘤直径达到8至9 mm时，每3天向肿瘤内注射miR-181d安塔戈米尔，然后在第16天处死小鼠(). 用miR-181d安塔戈米尔治疗的肿瘤与对照肿瘤相比，无论是在大小还是重量上都较小(). 结果表明，miR-181d antagomir显著抑制miR-181 d的表达体内(). 此外，IHC证实，用miR-181d安替戈米尔治疗的肿瘤中RBP2水平升高，p65水平降低(). Ki67染色证实体内肿瘤生长结果(). 总的来说，这些数据表明，抑制miR-181d抑制白血病细胞增殖体内miR-181d可能是抑制CML冲击转化的有效靶点。
抑制miR-181d抑制白血病细胞增殖体内试验。
（A）NOD/SCID雄性小鼠异种移植模型。miR-181d安替戈米尔给药实验的时间表。原发性肿瘤大体外观（B）和肿瘤生长曲线（C）和平均肿瘤重量（D）miR-181d安替戈米尔或对照治疗的异种移植模型。（E）RT-PCR分析显示各组miR-181d安替戈米尔的疗效。（F–I）对显示的肿瘤进行IHC染色和RBP2、p65和Ki67的相对IHC评分。在三个独立的实验中获得了类似的结果。（J）调查结果摘要。CML-BP发病机制中的一种新的表观遗传机制：在CML进展中，miR-181d的过度表达直接抑制RBP2的表达，低水平的RBP2不能抑制p65的表达，从而增加miR-181的表达并刺激细胞增殖*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001.
讨论
最近的研究表明，表观遗传失调在白血病中起着至关重要的作用。miR-181家族的异位表达通过抑制PRKCD、CTDSPL和CAMKK1的表达而阻断细胞分化，从而促进AML的发病(12). 小鼠中MiR-181a-1/b-1缺失抑制了Notch1诱导的T细胞急性淋巴细胞白血病的发展(25). 除了miR-181家族在白血病发病机制中的作用外，它们还介导耐药性。Zimmerman EI等人。表明miR181家族（a–d）在Lyn-介导的伊马替尼耐药CML（MYL-R）细胞中表达不足。miR181的Lyn依赖性调节是一种调节细胞存活的新机制，其在髓性白血病耐药中的作用(26). 而耐药是慢性粒细胞白血病爆发危机过渡的重要机制之一(27). 目前对BP的生物学基础仍知之甚少，它是一种复杂的分子网络机制，推动了疾病的发展。其中，miR-181d是否发挥重要作用尚未明确。
在这项研究中，我们证明了miR-181d介导CML的恶性转化，并且它在CML-BP的骨髓样本中过表达。在此之后，我们确定miR-181d的过度表达显著促进了白血病细胞的增殖。据报道，miR-181d调节细胞增殖的可能机制与NKAIN2、CDKN3和CYLD的调节有关(28–30). 作为miR-181d的靶点，NKAIN2基因敲除可以逆转miR-181d下调对胰腺癌发展的抑制作用(28)，CDKN3介导非小细胞肺癌（NSCLC）的发病机制(29)而CYLD调节侵袭介导的上皮-间充质转化（EMT），从而导致胃癌(30). 此外，CYLD是成人T细胞白血病/淋巴瘤（ATLL）生存的关键调节器(31). 越来越多的研究表明，这些报道的靶点在包括白血病在内的肿瘤发生中发挥着重要作用。这也说明了miR-181d的关键作用。在这里，针对表观遗传失调，我们揭示了一种新的机制，并表明miR-181d通过直接靶向和负调控组蛋白去甲基化酶RBP2促进白血病细胞增殖。
视网膜母细胞瘤结合蛋白2（RBP2）是JARID蛋白家族的成员，它通过特异性地去甲基化组蛋白3（H3K4）的三甲基和二甲基赖氨酸4而具有组蛋白去甲基酶活性(32). RBP2介导多种肿瘤的发病机制，如小细胞肺癌（SCLC）(33)，胃癌(34)、肾细胞癌（RCC）(35)等。除实体肿瘤外，我们之前的研究表明，在血液恶性肿瘤中，RBP2的低表达不能抑制miR-21的表达，从而促进CML从CP向BP的转变(16). 此外，RBP2表达不足通过激活RBP2/PTEN/BCR-ABL级联促进CML进展(36). 这些研究表明，RBP2表达失衡是肿瘤发展的重要初始因素。然而，CML爆发危机中RBP2表达失衡的原因尚不清楚。在本研究中，这些结果表征了RBP2在CML爆发危机中表达不足的机制，进一步揭示了表观遗传失调在CML冲击转化中的重要性。
RBP2富含AT的相互作用域可以识别特定的DNA序列CCGCCC(37)它包含在p65的启动子区域。我们发现，RBP2通过与p65启动子结合直接或负向调节p65的表达，而启动子依赖于其酶活性。RBP2过度表达显著下调p65 mRNA和蛋白水平。然而，RBP2 H483A质粒也过度表达RBP2，但没有脱甲基酶活性，不能抑制p65的表达。此外，荧光素酶报告子分析和ChIP分析表明RBP2直接与p65启动子结合。
最近的研究表明，miRNAs通过调节NF-κB通路在炎症和癌症中发挥重要作用(38，39). 然而，miRNAs是否能被NF-κB逆转尚不清楚。在这里，我们发现NF-κB/p65上调miR-181d的表达并形成反馈环。从机制上讲，miR-181d近端启动子包含NF-κB/p65的经典结合位点（GGGRNNYYCC R-嘌呤、Y-嘧啶、N-任意碱）(40). p65的过度表达显著上调了miR-181d的表达并激活了其启动子活性；而p65抑制则显著下调miR-181d的表达，并抑制miR-181d启动子的活性。然而，当结合位点突变时，相应的激活或抑制消失。此外，ChIP分析显示p65直接与miR-181d启动子序列结合。
总之，我们提供了证据，证明了一种新的表观遗传机制的存在，该机制参与了CML冲击转化(). 非编码RNA miR-181d在CML-BP中过度表达，从而促进白血病细胞增殖。从机制上讲，miR-181d下调组蛋白去甲基化酶RBP2的水平，该酶通过与p65启动子结合并去甲基化p65启动位点中的三/二甲基化H3K4区域来抑制白血病细胞中p65的表达。相反，p65通过直接与其启动子结合来上调成熟miR-181d的水平。这些发现可能为CML爆炸危机建立新的诊断标志物提供了一种方法。
数据可用性声明
本文中包含了研究中提出的原始贡献/
补充材料
。可向相应作者进行进一步查询。
道德声明
山东大学齐鲁医院伦理委员会对涉及人类参与者的研究进行了审查和批准。患者/参与者提供了参与本研究的书面知情同意书。该动物研究由山东大学齐鲁医院伦理委员会审查批准。
作者贡献
CC为研究设计、结果讨论和手稿修订做出了贡献。MZ为数据收集、分析和解释做出了贡献。XY为内部监管机制的验证做出了贡献。LZ和YW有助于统计分析和肿瘤异种移植模型。YF、XW、TH和JJ对结果的讨论做出了贡献。ZC和ZG收集患者的骨髓样本。所有作者都参与了这篇文章并批准了提交的版本。
基金
我们感谢国家自然科学基金（批准号81670146、81470318、81772151、81971901、82070164）、山东省重点研发项目（批准号2017GSF18109）和山东省自然科学基金的资助（批准号ZR2018PH013、ZR2019PH073），山东省科学技术厅（批准号2018CXGC1208）、山东大学齐鲁医院科学基金（批准号：2016QLQN09、2017QLQN34）、山东省免疫血液学开放研究计划重点实验室（批准号为2019XYKF006）。
利益冲突
作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或金融关系的情况下进行的。
工具书类
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