实验-治疗-医学。2021年4月；21(4): 398.
长非编码RNA SNHG7通过调节miR-146b-5p/Robo1轴促进胰腺癌进展
1和2
于健
1中国湖北省荆州市荆州市中心医院急诊科，邮编：434020
戚帆
2中国湖北省荆州市荆州市中心医院急诊科，邮编：434020
1中国湖北省荆州市荆州市中心医院急诊科，邮编：434020
2中国湖北省荆州市荆州市中心医院急诊科，邮编：434020
2019年8月1日收到；2020年3月24日验收。
- 数据可用性声明
本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。
摘要
长非编码RNA（lncRNA）小核仁RNA宿主基因7（SNHG7）在胰腺癌（PC）的进展中起着至关重要的作用。SNHG7在PC中上调；因此，本研究旨在探讨SNHG7在PC进展中的作用及其潜在机制。在本研究中，通过逆转录定量PCR检测SNHG7、microRNA（miR）-146b-5p和环状同源物1（Robo1）的mRNA表达水平。此外，分别用MTT和流式细胞仪检测细胞活力和凋亡。通过Transwell分析评估细胞迁移和侵袭的能力。此外，还进行了双核糖核酸酶报告、RNA免疫沉淀和RNA下拉分析，以评估miR-146b-5p与SNHG7或Robo1之间的相互作用。western blotting检测Robo1的蛋白表达。此外，还建立了小鼠异种移植模型，以进一步研究SNHG7对PC进展的影响体内结果表明，SNHG7在PC组织和细胞中高度表达。还发现SNHG7被miR-146b-5p所吸附，Robo1是miR-146b-5p的靶点。此外，SNHG7敲除抑制PC细胞的增殖、迁移和侵袭，以及肿瘤发生和凋亡在体外和体内通过调节miR-146b-5p。结果还表明，miR-146b-5p过度表达通过调节Robo1抑制PC细胞的生长。此外，SNHG7沉默通过海绵miR-146b-5p下调Robo1表达。总之，本研究结果表明SNHG7通过海绵miR-146b-5p和上调Robo1促进PC进展。
关键词：长非编码RNA小核仁RNA宿主基因7，microRNA-146b-5p，迂回同源物1，胰腺癌，癌症进展
介绍
胰腺癌（PC）是世界范围内发生的一种致命肿瘤，与患者预后差和老年患者的高发病率有关，诊断时的平均年龄为71岁(1，2). 目前，切除术是延长PC患者生存时间的最有效治疗方法(三). 然而，在过去几十年中，早期诊断并没有实质性的改善(4)约80%的PC患者错过了手术切除的最佳时间(5). 因此，寻找新的生物标志物对PC的早期诊断具有重要意义。
长度大于200个核苷酸的长非编码RNA（lncRNA）是一种缺乏翻译能力的转录物，可以在转录或转录后阶段影响靶基因(6). 已有研究表明，许多lncRNA参与了PC的进展。例如，lncRNA分化拮抗非蛋白编码RNA（DANCR）通过海绵microRNA（miRNA/miR）-135a促进PC细胞增殖和侵袭(7). 此外，其他lncRNA，如CCDC26 lncRNA(8)，Pvt1癌基因（Pvt1）(9)，尿路上皮癌相关1（UCA1）(10)和ZEB2反义RNA 1（ZEB2-AS1）(11)小核仁RNA宿主基因7（SNHG7）位于染色体9q34.3上，全长984 bp，在多种肿瘤中异常表达，包括肺癌(12)，胃癌(13)、胶质母细胞瘤(14)和PC(15). 然而，据我们所知，很少有研究探讨SNHG7在PC中的生物学机制。
miRNAs长约22个核苷酸，是一种小的非编码RNA，没有翻译能力，通过抑制mRNA翻译或介导mRNA降解来限制基因表达(16). 以前的研究表明，一些miRNAs，如miR-135b-5p(17)，miR-613(18)和miR-1181(19)，调节失调并影响PC进展。还发现miR-146b-5p与PC进展有关(20). 此外，位于人类染色体3p12.3上的环状同源物1（Robo1）与前列腺癌的肿瘤进展过程有关(21). 因此，本研究旨在研究SNHG7在PC中的功能和机制，从而为PC患者提供新的治疗靶点。
材料和方法
纸巾收集
本研究由荆州市中心医院伦理委员会（中国湖北荆州）批准，并根据赫尔辛基原则宣言进行。患者年龄为20-81岁，其中女性18人，男性32人。2016年3月至2018年8月，共从荆州市中心医院采集了50份PC组织样本，包括20份I-II期PC样本和30份III-IV期PC样本，以及50份相应的相邻健康组织样本。用于PC的分期系统是美国癌症联合委员会肿瘤淋巴结转移（TNM）系统(22). 根据RT-qPCR测定的SNHG7表达水平的中位数，将收集的PC组织样本分为两组：i）SNHG7-高表达PC患者（n=25）；和ii）SNHG7低表达的PC患者（n=25）。所有组织在80˚C下冷冻，直到进一步分析。实验前，所有PC患者都提供了书面知情同意书。
逆转录定量PCR（RT-qPCR）
使用TRIzol从PC组织样品或细胞中提取RNA®试剂（Invitrogen；赛默飞世尔科学公司）。使用特定引物（Takara Biotechnology Co.，Ltd）通过PrimeScript靶向RT SNHG7和Robo1™RT Master Mix套件（Takara生物技术有限公司）。简言之，在10µl反应混合物中执行转录，其中包括聚腺苷化RNA（100 ng）、5XPrimeScript缓冲液（2µl）、PrimeScript RT酶混合物I（0.5µl。将总反应混合物在50℃培养15分钟，在85℃培养5秒。
而miR-146b-5p的RT使用TaqMan miRNA分析进行（Applied Biosystems；Thermo Fisher Scientific，Inc.）。qPCR使用SYBR Premix Ex Taq II（塔卡拉生物科技有限公司）进行。扩增参数如下：95℃变性10分钟，然后在95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟。SNHG7、miR-146b-5p和Robo1的相对表达水平用GAPDH或小核RNA U6标准化，然后用2-ΔΔCq公司方法(23). 引物由Songon Biotechj Co.，Ltd.合成，列于.
表一
| 基因 | 序列 |
|---|
| SNHG7型 | F： 5’-AGGCTGGCTGGAATAAGGT-3’ |
| | R： 5’-TATGAAAGGGAGGCGTGGT-3’ |
| miR-146b-5p | F： 5’-GATGAGGTATTTCTCT-3’ |
| | R： 5'-GAGAAAATTGAAGGTCATAAA-3' |
| 机器人1 | F： 5'-GAACAGCGCAACCT-3' |
| | R： 5'-TGACAAAACGCCCATCCT-3' |
| GAPDH公司 | F： 5’-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3’ |
| | R： 5'-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3’ |
| 6号机组 | F： 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’ |
| | R： 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’ |
MTT分析
MTT（Sigma-Aldrich；Thermo Fisher Scientific，Inc.）用于评估SW1990和AsPC-1细胞的活性。单元格（6x10三每个孔）接种在96孔板中，并在37˚C下孵育24小时。转染后，细胞在37˚C下再培养0、24、48或72小时。随后，将MTT（5 mg/ml）添加到每个孔中，并在37°C下培养4小时。然后，添加150µl二甲基亚砜（Sigma-Aldrich；Merck KGaA）以溶解甲氮。通过Multiscan Spectrum（北京普天新桥技术有限公司）测量490nm处的吸光度。
细胞凋亡的流式细胞术分析
采用Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）凋亡检测试剂盒（北京索拉比奥科技有限公司）评估细胞凋亡率。转染的SW1990和AsPC-1细胞（1x105)将其重新悬浮在结合缓冲液（北京太阳生物科技有限公司）中，在室温下与5µl膜联蛋白V-FITC在黑暗中孵育10分钟，然后与10µl PI孵育5分钟。使用流式细胞仪（安捷伦2100生物分析仪；安捷伦科技公司）评估细胞凋亡率，并使用Cell Quest 3.0软件（BD Biosciences）进行分析。
Transwell分析
使用带有8-µm孔插入物的Transwell腔室（Corning，Inc.）评估SW1990和AsPC-1细胞的迁移和侵袭能力。对于迁移能力，以1x10的密度转染SW1990和AsPC-1细胞5将细胞/孔置于添加有非FBS DMEM的上室中，而下室中包含添加有10%FBS的DMEM。培养24h后，细胞在4%甲醇中室温固定20min，并在室温下用0.1%结晶紫染色30min。用荧光显微镜分析10个随机区域中的细胞（放大倍率，x100；奥林巴斯公司）。为了提高细胞侵袭能力，在4˚C下用Matrigel基质（BD Biosciences）覆盖上腔，然后在37˚C培养5小时。
双荧光素酶报告分析
starBase v2.0预测了miR-146b-5p与SNHG7或Robo1之间的相互作用(http://starbase.sysu.edu.cn/)和TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)在线数据库。扩增SNHG7的野生型（WT）和突变型（MUT）片段，然后将其插入pGL3载体（Promega Corporation）以构建荧光素酶报告子，分别称为SNHG7-WT和SNHG7MUT。荧光素酶报告子（0.1µg）和miR-146b-5p模拟物（40 nM）或miR-对照物（40 n M）使用脂质体共同转染到SW1990和AsPC-1细胞®2000年（Invitrogen；赛默飞世尔科技公司）。荧光素酶报告子Robo3’untranslated region（UTR）WT（GUUCA）或Robo1’UTR MUT（ACCAAUG）的结构与SNHG7 WT（CAGTTCC）或SNHG7MUT（ATCAAGCA）报告子相似。荧光素酶活性使用双荧光素素酶检测试剂盒（北京索拉比奥科技有限公司）进行评估。雷尼利亚荧光素酶活性被用作萤火虫荧光素酶活性正常化的内部控制。
RNA免疫沉淀（RIP）分析
在对转染的SW1990和AsPC-1细胞进行裂解后，用标记有抗精氨酸-2（Ago2；BIOSS）或阴性对照抗IgG抗体（BIOSS。然后，用DNAse I（20 U；Sigma-Aldrich；Merck KGaA）在37˚C下处理15分钟，用蛋白酶K（0.5 mg/ml；Sigma Aldrich，Merck KGaA）在55˚C上处理15分钟。输入作为阳性对照。随后，如前所述，通过RT-qPCR检测SNHG7的表达。
RNA下拉分析
生物素（Bio）标记的miR-146b-5p（Bio-miR-146b-5p；正向：5'-ugagaacuc gccgcggaccg c-3'；反向：5'-gcggucccgcgcgaguucuca-3'）及其阴性对照（Bio-NC；正向：5'-uucucgaacguuc acgutt-3'；反向：5'-accugacguucg agaatt-3'）来自Sangon Biotech Co.，Ltd.SW1990和AsPC-1细胞（3x106)使用Lipofectamine转染Bio-miR-146b-5p或最终浓度为100 nM的Bio-NCata®2000年（Invitrogen；赛默飞世尔科技公司）。随后，将细胞在特定的裂解缓冲液（Ambion；Thermo Fisher Scientific，Inc.）中裂解10分钟，并将裂解产物（RNA-RNA复合物）与链霉亲和素磁珠（Dyna beads M-280链霉菌亲和素；Invitrogen；Thermo-Fisher科学公司）结合，然后在4˚C下培养3小时。在用500µl预冷裂解缓冲液两次洗脱、用低盐缓冲液三次洗脱和用高盐缓冲液一次洗脱后，用Trizol纯化结合RNA®试剂（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.），然后通过RT-qPCR检测SNHG7的表达。
蛋白质印迹
蛋白质样品用RIPA裂解缓冲液（贝尤蒂姆生物技术研究所）提取，然后用BCA蛋白质检测试剂盒（贝尤蒂生物技术研究院）定量。接下来，用10%SDS-PAGE分离50µg每个蛋白质样品，然后转移到PVDF（Absin Bioscience，Inc.）膜上。随后，将膜在37˚C的5%脱脂牛奶中封闭2小时，并在4˚C下与抗Robo1（类别号ab7279；1:1000；Abcam）和GAPDH（类别号ab8227；1:5000；Abcam）的一级抗体孵育过夜，GAPDH作为内部参照物。然后，将膜与第二抗体（分类号ab205178；1:10000；Abcam）在37˚C下再孵育2小时。使用eyoECL Plus试剂盒（Beyotime生物技术研究所）检测带强度，并使用Quantity One v4.6.2软件（Bio-Read Laboratories，Inc.）进行分析。
小鼠异种移植模型
裸鼠实验得到荆州市中心医院动物护理委员会的批准，并按照国家卫生研究院的指南进行(24). 从上海实验动物中心购买了总共10只雄性裸鼠（年龄，6周，体重16-22克；每组n=5只），然后在25˚C的温度和45%至50%的相对空气湿度下保持在无特定病原体的条件下。随后，100µl SW1990电池（5x106将稳定转染sh-SNHG7的细胞/ml）皮下注射到裸鼠背侧翼的单侧。接种后，每5天根据以下公式计算肿瘤体积：体积（mm三)=宽度2x长度/2。细胞注射后30天，使用2%甲氧氟烷和颈椎脱位对小鼠实施安乐死。随后，切除异种移植瘤样本进行重量测量，然后用RT-qPCR和western blot分析。
统计分析
使用GraphPad Prism 7（GraphPad-Software，Inc.）进行数据分析。所有实验重复三次，数据表示为平均值±SD。χ2本试验用于分析SNHG7表达与PC患者临床病理特征的相关性。使用Kaplan-Meier方法绘制总生存曲线，并使用对数秩检验进行评估。Pearson相关分析用于分析表达相关性。两组之间的比较通过Student t检验进行分析，而多组之间的对比通过单向方差分析和Tukey检验进行计算。P<0.05被认为表明存在统计学上的显著差异。
结果
SNHG7在前列腺癌组织中显著上调，与前列腺癌患者肿瘤大小、远处转移、淋巴结转移和TNM分期的病理特征相关
为了评估SNHG7在前列腺癌中的作用，在50例前列腺癌组织样本和相应的相邻健康组织样本中检测了SNHG7-的表达。研究发现，与健康组织样本相比，前列腺癌组织中SNHG7的表达显著增强(). 此外，SNHG7在III-IV期样本中的表达高于I-II期样本（P<0.05；). Kaplan-Meier生存分析结果表明，与SNHG7低表达的PC患者相比，SNHG7-高表达的PC的生存率较低(). 此外，χ2检测结果表明，SNHG7的高表达与肿瘤大小（P=0.005）、远处转移（P=0.011）、淋巴结转移（P=0.004）和TNM分期（P=0.004）密切相关，而其表达与性别和年龄无关(). 因此，结果表明，SNHG7在PC组织中显著升高，并与PC患者肿瘤大小、远处转移、淋巴结转移和TNM分期的病理特征有关。
SNHG7在前列腺癌组织中显著上调，并与前列腺癌患者的肿瘤大小、远处转移、淋巴结转移和TNM分期等病理特征相关。采用逆转录定量PCR方法检测SNHG7-在（A）前列腺癌组织或（B）不同肿瘤分期中的表达。（C） 总生存率与SNHG7表达之间的关系。*与各正常组相比，P<0.05。SNHG7，小核仁RNA宿主基因7。
表二
前列腺癌患者SNHG7表达与临床病理特征的相关性。
| | | SNHG7表达 | |
|---|
| 特点 | 总计（n=50） | 低（n=25） | 高（n=25） | P值一 |
|---|
| 性别 | | | | 0.556 |
| 雄性 | 32 | 15 | 17 | |
| 女性 | 18 | 10 | 8 | |
| 年龄 | | | | 0.564 |
| ≤60 | 20 | 9 | 11 | |
| >60 | 30 | 16 | 14 | |
| 肿瘤大小，cm | | | | 0.005b条 |
| ≤2 | 26 | 18 | 8 | |
| >2 | 24 | 7 | 17 | |
| 远处转移 | | | | 0.011b条 |
| 不存在 | 25 | 17 | 8 | |
| 出席 | 25 | 8 | 17 | |
| 淋巴结转移 | | | | 0.004b条 |
| 否定 | 30 | 20 | 10 | |
| 积极的 | 20 | 5 | 15 | |
| TNM阶段 | | | | 0.004b条 |
| I-II型 | 28 | 19 | 9 | |
| III-IV类 | 22 | 6 | 16 | |
SNHG7敲除抑制PC细胞的增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡
基于上述结果，本研究检测了SNHG7在PC细胞中的表达。结果表明，与HPDE细胞相比，SNHG7在PANC-1、BxPC-3、SW1990和AsPC-1细胞中显著上调()最显著的是SW1990和AsPC-1细胞。因此，选择SW1990和AsPC-1细胞进行后续实验。此外，检测了sh-SNHG7和pc-SNHG6的转染效率，并在和随后，将sh-SNHG7转染SW1990和AsPC-1细胞，研究SNHG7的功能。MTT分析结果表明，当SNHG7被敲除时，SW1990和AsPC-1细胞的活性显著降低(和). 此外，我们发现sh-SNHG7的转染导致SW1990和AsPC-1细胞的凋亡率显著增加(和). 此外，与阴性对照组相比，SW1990和AsPC-1细胞的迁移和侵袭能力均显著降低(和). 总之，沉默SNHG7可以抑制SW1990和AsPC-1细胞的增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡。
SNHG7敲低损害细胞增殖、迁移和侵袭，但诱导SW1990和AsPC-1细胞凋亡。（A） 通过逆转录定量PCR检测SNHG7在人胰腺癌细胞系PANC-1、BxPC-3、SW1990和AsPC-1以及人胰腺正常导管上皮细胞系HPDE中的表达。在SW1990和转染（B）sh-control和sh-SNHG7或（C）pcDNA-NC和pcDNA-SNHG7的AsPC-1细胞中检测到SNHG7-表达。SW1990和AsPC-1细胞转染sh-control、sh-SNHG7或在正常条件下培养。通过MTT法评估（D）SW1990和（E）AsPC-1细胞中的细胞活力。通过流式细胞术评估（F）SW1990和（G）AsPC-1细胞的凋亡率。（H） 用Transwell法检测转染细胞的迁移和（I）侵袭能力。比例尺，100µm。*与各自的正常组相比，P<0.05。sh，短发夹RNA；SC，（标准条件）；SNHG7，小核仁RNA宿主基因7；外径，光密度。
miR-146b-5p海绵SNHG7
研究SNHG7在PC进展starBase v2.0中的生物学机制(http://starbase.sysu.edu.cn)用于预测SNHG7的假定靶点，并确定miR-146b-5p与SNHG7具有互补位点(). 随后，双荧光素酶报告子分析结果表明，与miR-对照组相比，miR-146b-5p转染显著下调SW1990和AsPC-1细胞中SNHG7 WT报告子的荧光素素酶活性(和). 然而，在任何组中，SNHG7 MUT报告者的荧光素酶活性没有显著差异(和).
miR-146b-5p是SNHG7的直接靶点。（A） miR-146b-5p与SNHG7之间的互补序列，以及SNHG7MUT序列。通过双荧光素酶报告子评估转染miR-146b-5p或miR-control的（B）SW1990和（C）AsPC-1细胞中SNHG7 WT或SNHG7-MUT报告子的荧光素酶活性。（D） 通过RIP分析评估抗Ago2或抗IgG标记的SW1990细胞中SNHG7在转染miR-146b-5p或miR-control的细胞中的富集情况。（E） 通过RNA下拉试验分析转染Bio-miR-146b-5p或Bio-NC的SW1990细胞中SNHG7的富集情况。（F） 通过RIP分析评估抗Ago2或抗IgG标记的AsPC-1细胞中SNHG7在转染miR-146b-5p或miR-control的细胞中的富集情况。（G） 通过RNA下拉试验分析转染Bio-miR-146b-5p或Bio-NC的AsPC-1细胞中SNHG7的富集情况。在（H）SW1990和（I）转染miR-control或miR-146b-5p的AsPC-1细胞中检测miR-146b-5p探针的转染效率。在SW1990和转染（J）miR-control和miR-146b-5p或（K）抑制剂control及miR-146b-5p抑制剂的AsPC-1细胞中检测miR-146b5p的表达。（五十） 通过逆转录定量PCR检测转染sh-control、sh-SNHG7、pcDNA-control或pcDNA-SNHG7的细胞中miR-146b-5p的表达。（M） 采用Pearson检验分析SNHG7与miR-146b-5p的相关性。*与各自的正常组相比，P<0.05。WT，野生型；MUT，突变体；SNHG7，小核仁RNA宿主基因7；miR，microRNA；sh，短发夹RNA；NC，阴性对照；Ago2，argonaute-2。
与IgG抗体组相比，SW1990和转染miR-146b-5p的AsPC-1细胞中的Ago2抗体显著富集了SNHG7(和). 此外，RNA下拉分析结果表明，Bio-miR-146b-5p在SW1990和AsPC-1细胞中的SNHG7富集度低于Bio-miR-146b-5p-Input组，而Bio-NC组在PC细胞中的SNHG7的富集度也低于NC-Input组(和). 还发现Bio-miR-146b-5p在SW1990和AsPC-1细胞中的转染是成功的(和).
此外，检测miR-146b-5p模拟物和抑制剂对miR-146b-5p表达上调或下调的转染效率(和). 结果表明，通过沉默SNHG7，miR-146b-5p在SW1990和AsPC-1细胞中的表达显著升高，而过表达SNHG7miR-146b5p则显著降低(). 根据相关性的解释，还发现miR-146b-5p的表达与SNHG7呈弱负相关(25) (). 因此，推测miR-146b-5p可能与SNHG7负相互作用。
miR-146b-5p抑制剂减轻SNHG7沉默对SW1990和AsPC-1细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用以及对细胞凋亡的促进作用
为了检测SNHG7对PC进展的影响是否由miR-146b-5p介导，将sh-SNHG7和miR-146b5p抑制剂联合转染到SW1990和AsPC-1细胞。结果发现，miR-146b-5p在sh-SNHG7转染的SW1990和AsPC-1细胞中的表达显著增加，而在miR-146b-5p抑制剂转染后表达显著降低(和). 此外，miR-146b-5p抑制剂降低了对SW1990和AsPC-1细胞活力和迁移和侵袭能力的抑制作用，而这些细胞被SNHG7敲除所抑制(和;和). 然而，sh-SNHG7转染提高了SW1990和AsPC-1细胞的凋亡率，但这种促进作用被miR-146b-5p抑制剂减弱(和). 总之，结果表明，沉默SNHG7可减少SW1990和AsPC-1细胞的增殖、迁移和侵袭，但通过调节miR-146b-5p可促进细胞凋亡。
miR-146b-5p抑制剂减轻了对细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，并降低了SNHG7沉默对SW1990和AsPC-1细胞凋亡的影响。SW1990和AsPC-1细胞转染sh-control、sh-SNHG7、sh-SNHG7+抑制剂对照或sh-SNHG7+miR-146b-5p抑制剂。通过逆转录定量PCR检测miR-146b-5p在（A）SW1990和（B）AsPC-1细胞中的表达。通过MTT法评估（C）SW1990和（D）AsPC-1细胞的细胞活力。通过流式细胞术评估（E）SW1990和（F）AsPC-1细胞的凋亡率。（G） 通过Transwell分析检测迁移和（H）侵袭能力。*与各正常组相比，P<0.05。SNHG7，小核仁RNA宿主基因7；miR，microRNA；sh，短发夹RNA；外径，光密度。
Robo1与miR-146b-5p发生负面反应
为了确定miR-146b-5p在PC中的生物学机制，TargetScan在线数据库(http://www.targetscan.org)用于预测miR-146b-5p的潜在候选靶点。结果表明，Robo1 3'UTR与miR-146b-5p具有互补的结合位点(). 此外，双荧光素酶报告子分析结果发现，在SW1990和转染miR-146b-5p的AsPC-1细胞中，Robo1 3'UTR WT报告子的荧光素素酶活性显著降低，而miR-对照组没有显著变化。然而，Robo1 3'UTR MUT报告基因的萤光素酶活性在任何一组中都没有显著波动(和).
Robo1与miR-146b-5p发生负面反应。（A） miR-146b-5p和Robo1 3'UTR之间的互补结合位点，以及Robo1 3'UTR的MUT序列。通过双荧光素酶报告子分析评估转染miR-146b-5p模拟物或miR-control的（B）SW1990和（C）AsPC-1细胞中Robo1 3'UTR WT或Robo1 3'UTR MUT报告子的荧光素素酶活性。（D） 在SW1990和转染载体和Robo1的AsPC-1细胞中检测Robo1 mRNA和（E）蛋白的表达水平。（F） 用逆转录定量PCR和western blotting分别检测转染miR-control、miR-146b-5p、抑制剂control或miR-146b-5p抑制剂的（G）SW1990和（H）AsPC-1细胞中Robo1的mRNA和蛋白表达水平。（一） Robo1和miR-146b-5p之间的相关性通过Pearson检验进行评估。*与各自的正常组相比，P<0.05。3'UTR，3'非翻译区；MUT，突变体；WT，野生型；miR，microRNA；机器人1，环岛同源物1；SNHG7，小核仁RNA宿主基因7。
此外，通过RT-qPCR和western blotting检测Robo1在SW1990和AsPC-1细胞中过度表达的转染效率(和). 结果表明，在SW1990和转染miR-146b-5p模拟物的AsPC-1细胞中，Robo1的mRNA和蛋白表达水平显著降低，而在miR-146b-5p抑制剂组中，两者均显著增强(). 此外，结果表明Robo1的表达与miR-146b-5p呈中度负相关(). 因此，推测Robo1可能是miR-146b-5p的直接靶点。
Robo1过表达减轻了miR-146b-5p模拟物对SW1990和AsPC-1细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用以及对凋亡的增强作用
基于上述结果，我们发现Robo1与miR-146b-5p呈负相互作用。随后，本研究检测了miR-146b-5p和Robo1在PC中的功能。结果表明，转染miR-146b-5p的SW1990和AsPC-1细胞中Robo1的mRNA和蛋白表达水平降低，而Robo1过度表达则使其表达水平增加(). 此外，Robo1的过度表达降低了miR-146b-5p对SW1990和AsPC-1细胞活力、迁移和侵袭的抑制作用(和;和). 流式细胞术结果还表明，Robo1的过度表达逆转了miR-146b-5p上调对SW1990和AsPC-1细胞凋亡率的抑制作用(和). 因此，结果表明miR-146b-5p通过调节Robo1降低了PC细胞的增殖、迁移和侵袭，但增加了细胞凋亡。
Robo1过表达减轻了对细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，并降低了miR-146b-5p模拟物诱导的SW1990和AsPC-1细胞凋亡的影响。用miR-control、miR-146b-5p、miR-46b-5p+载体或miR-146b-5p+Robo1转染SW1990和AsPC-1细胞。采用逆转录定量PCR方法检测Robo1在（A）SW1990和（B）AsPC-1细胞中的表达。western blotting检测Robo1在（C）SW1990和（D）AsPC-1细胞中的蛋白表达。通过MTT法评估（E）SW1990和（F）AsPC-1细胞中的细胞活力。用流式细胞术检测（G）SW1990和（H）AsPC-1细胞的凋亡率。（一） 通过Transwell分析检测转染SW1990和AsPC-1细胞的迁移和（J）侵袭能力。*与各正常组相比，P<0.05。miR、微小RNA；机器人1，环岛同源物1；SNHG7，小核仁RNA宿主基因7；外径，光密度。
沉默SNHG7通过海绵miR-146b-5p下调Robo1的表达
结果表明，Robo1的表达与SNHG7的表达呈强正相关(). 为了研究SNHG7、miR-146b-5p和Robo1之间的关系，将sh-SNHG7和miR-146b-5p抑制剂联合转染到SW1990和AsPC-1细胞中。发现转染sh-SNHG7的SW1990和AsPC-1细胞中Robo1的mRNA和蛋白表达水平显著降低，而转染miR-146b-5p抑制剂后Robo1 mRNA和蛋白质表达水平增加(). 因此，SNHG7的缺失通过充当miR-146b-5p海绵降低了Robo1的表达。
SNHG7沉默通过靶向miR-146b-5p下调Robo1的表达。（A） Robo1和SNHG7之间的相关性通过Pearson检验确定。用sh-control、sh-SNHG7、sh-SNHG7+抑制剂或sh-SNHG7+miR-146b-5p抑制剂转染SW1990和AsPC-1细胞。（B） 采用逆转录定量PCR检测Robo1的mRNA表达。western blotting检测Robo1在（C）SW1990和（D）AsPC-1细胞中的蛋白表达。*与各正常组相比，P<0.05。miR，microRNA；机器人1，环岛同源物1；小核仁RNA宿主基因7；sh，短发夹RNA。
SNHG7敲除抑制体内异种移植瘤生长
为了进一步评估SNHG7在PC中的功能，SW1990细胞被sh-SNHG7或sh对照转染，然后注射到裸鼠体内。经过30天的测量，结果表明，与sh对照组相比，sh-SNHG7组的肿瘤体积和重量均显著降低(). 此外，肿瘤的最大直径和体积分别为18.32 mm和768.56 mm三分别是。此外，在sh-SNHG7组中，SNHG7的表达显著下调，而miR-146b-5p的表达显著升高(和). 结果还表明，sh-SNHG7组Robo1的mRNA和蛋白表达水平显著降低(和). 总之，结果表明SNHG7敲除抑制异种移植瘤生长体内.
SNHG7沉默阻断异种移植物肿瘤生长体内给小鼠注射转染sh-SNHG7或sh-对照的SW1990细胞。（A） 介绍了PC异种移植组织的典型图像。（B） 治疗小鼠的肿瘤体积。（C） 治疗小鼠的异种移植瘤重量。通过逆转录定量PCR检测异种移植瘤中（D）SNHG7、（E）miR-146b-5p和（F）Robo1的mRNA表达水平。（G） western blotting检测Robo1在异种移植瘤中的蛋白表达。*与相应的正常组相比P＜0.05。miR，microRNA；机器人1，环岛同源物1；SNHG7，小核仁RNA宿主基因7；sh，短发夹RNA。
讨论
PC是一种世界范围内发生的致命癌症，通常与预后不良有关(1，26). 以前的研究表明，lncRNAs与各种癌症的进展有关(27-29). 例如，郭等(30)据报道，lncRNA HNF1A-AS1敲除通过靶向结直肠癌中的miR-124/MYO6抑制细胞迁移、侵袭和糖酵解。锂等(31)证明LncRNA-FTX通过调节miR144/Axis在胃细胞增殖和侵袭中发挥促进作用。此外，Feng等(32)证实lncRNA NEAT1通过促进PC发育中的细胞增殖和转移发挥致癌因子的作用。本研究主要研究SNHG7在PC进展中的作用和机制，发现lncRNA SNHG7-敲除通过miR-146b-5p/Robo1轴抑制PC进展。
先前的研究表明，SNHG1的异常表达发生在各种类型的癌症中，包括PC。例如，一项针对黑色素瘤的研究表明SNHG7在黑色素瘤组织中显著升高，其沉默抑制细胞迁移和侵袭在体外(33). 另一项甲状腺癌研究表明，SNHG7在甲状腺癌组织中上调；SNHG7的缺失抑制细胞增殖，但诱导甲状腺癌细胞凋亡(34). 徐等(35)据报道，SNHG7在人膀胱癌中的表达显著增强，SNHG 7敲除抑制细胞增殖和转移，但诱导SW780、T24、UMUC和5637细胞凋亡。目前的结果表明，SNHG7在PC组织和细胞系中的表达显著上调，并且与低度恶性肿瘤相比，在高级别肿瘤中的表达增加。此外，SNHG7的高表达与PC的病理特征有关。此外，功能实验结果表明，SNHG 7沉默可减少PC细胞的增殖、迁移和侵袭，同时促进PC细胞的凋亡。研究还表明，SNHG7的缺失降低了异种移植瘤的生长体内因此，SNHG7的这些结果与之前的研究一致(15)并提示SNHG7可能促进PC进展。
lncRNA可以作为竞争性内源性RNA来招募miRNA，进而影响靶基因的表达。例如，之前的一项研究表明，SNHG7海绵可以促进miR-186促进乳腺癌的进展(36). 另一项针对乳腺癌的研究表明，SNHG7通过海绵状miR-34a增加细胞增殖、侵袭和上皮-间质转化(37). 程等(15)据报道，SNHG7敲除通过miR-342-3p在PC中阻断细胞增殖、迁移和侵袭。此外，修复实验结果表明，miR-146b-5p抑制剂诱导SW1990和转染sh-SNHG7的AsPC-1细胞miR-146b-5p表达降低。还发现SNHG7沉默通过调节miR-146b-5p抑制PC进展。因此，推测SNHG7通过海绵miR-146b-5p加速PC进展。
研究表明，Robo1的失调与癌症进展有关。例如，先前对肝细胞癌的研究表明，Robo1在肝细胞癌组织和细胞中显著增加，其过度表达可减少miR-490-5p调节的肝细胞癌进展在体外(38). 目前的结果通过双荧光素酶报告分析鉴定了miR-146b-5p和Robo1之间的相互作用。此外，研究表明，Robo1过表达减弱了对细胞活力、迁移和侵袭的抑制作用，以及miR-146b-5p模拟物对细胞凋亡的促进作用。目前关于PC中Robo1的研究结果与之前的研究结果一致(21). 此外，还发现SNHG7通过海绵化PC细胞中的miR-146b-5p增加了Robo1的表达。因此，本研究结果表明，SNHG7通过海绵miR-146b-5p调节Robo1的表达，促进细胞增殖、迁移和侵袭，并抑制PC中的凋亡。
总之，SNHG7在PC组织和细胞中的表达显著增加。根据功能和机械实验的结果，推测SNHG7通过吸收miR-146b-5p来正向调节Robo1的表达，这有助于促进PC的进展。因此，这种新型调控网络可能为PC患者提供新的治疗靶点。
数据和材料的可用性
本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。
作者的贡献
YJ负责研究设计的概念化和实验的执行。YJ进行了数据采集。YJ和QF完成了手稿的撰写和审查。YJ负责研究监督。QF进行了正式分析和数据管理。所有作者阅读并批准了手稿，并同意对研究的所有方面负责，以确保适当调查和解决工作任何部分的准确性或完整性。
道德批准和参与同意
本研究由荆州市中心医院伦理委员会批准。从每位患者处获得书面知情同意书。
工具书类
1Siegel RL，Miller KD，Jemal A.癌症统计，2016。CA癌症临床杂志。2016;66：7-30.doi:10.3322/caac.21332。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 三。Aarink A、Richard C、Truntzer C、Vincent J、Bengrine L、Vienot A、Borg C、Ghiringhelli F。基线脾脏体积作为FOLFIRINOX治疗晚期胰腺癌疗效的替代指标。Oncotarget公司。2018;9:25617–25629. doi:10.18632/noctarget.25424。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 4Paulson AS、Tran Cao HS、Tempero MA、Lowy AM。胰腺癌的治疗进展。胃肠病学。2013;144:1316–1326. doi:10.1053/j.gastro.2013.01.078。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 5De Luca R，Blasi L，AlóM，Gristina V，Cicero G。萘哌噻酮治疗转移性胰腺癌的临床疗效。药物开发治疗。2018;12:1769–1775. doi:10.2147/DDDT。S165851。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 6Yang G，Lu X，Yuan L.LncRNA：RNA与癌症之间的联系。Biochim生物物理学报。2014;1839:1097–1109. doi:10.1016/j.bbagrm.2014.08.012。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 7唐毅，曹刚，赵刚，王C，秦清。LncRNA分化拮抗非蛋白编码RNA通过调节miR-135a/NLRP37轴促进胰腺癌的增殖和侵袭。投资新药。2019;38:714–721. doi:10.1007/s10637-019-00798-0。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 8彭伟，江安龙非编码RNA CCDC26作为一种潜在的预测生物标记物对胰腺癌的肿瘤发生有贡献。生物药物治疗。2016;83：712–717。doi:10.1016/j.biopha.2016.06.059。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 9Zhang X，Feng W，Zhang J，Ge L，ZhangY，Jiang X，Peng W，Wang D，Gong A，Xu M.Long非编码RNA PVT1通过TGF-β/Smad途径促进胰腺癌细胞的上皮间质转化。Oncol代表。2018;40：1093–1102。doi:10.3892/或.2018.6462。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 10Zhang M，Zhao Y，Zhang Y，Wang D，Gu S，Feng W，Peng W，Gong A，Xu M.LncRNA UCA1通过河马途径促进胰腺癌细胞的迁移和侵袭。Biochim Biophys Acta Mol基础疾病。2018;1864:1770–1782. doi:10.1016/j.bbadis.2018.03.005。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 11Gao H，Gong N，Ma Z，Miao X，Chen J，Cao Y，Zhang G.LncRNA ZEB2-AS1通过调节miR-204/HMGB1轴促进胰腺癌细胞生长和侵袭。国际生物大分子杂志。2018;116:545–551. doi:10.1016/j.ijbioc.2018.05.044。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 12She K，Huang J，Zhou H，黄T，Chen G，He J.lncRNA-SNHG7通过增强FAIM2的表达促进肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并抑制其凋亡。Oncol代表。2016;36：2673–2680。doi:10.3892/或.2016.5105。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 13Wang MW，Liu J，Liu Q，Xu QH，Li TF，Jin S，Xia TS.LncRNA SNHG7通过抑制P15和P16的表达促进胃癌细胞的增殖和抑制凋亡。欧洲药理学评论。2017;21:4613–4622.[公共医学][谷歌学者] 14任杰，杨毅，薛杰，奚Z，胡磊，潘世杰，孙琼。长非编码RNA SNHG7通过抑制miR-5095促进胶质母细胞瘤的进展和生长。生物化学与生物物理研究委员会。2018;496:712–718. doi:10.1016/j.bbrc.2018.01.109。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 15Cheng D，Fan J，Ma Y，Zhou Y，Qin K，Shi M，Yang J.LncRNA SNHG7通过海绵miR-342-3p通过ID4促进胰腺癌增殖。细胞生物学。2019;9（28）doi:10.1186/s13578-019-0290-2。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 已缩回 16Esteller M.人类疾病中的非编码RNA。Nat Rev基因。2011;12:861–874. doi:10.1038/nrg3074。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 17Zhang Z，Che X，Yang N，Bai Z，Wu Y，Zhao L，Pei H.MiR-135b-5p通过靶向NR3C2促进胰腺癌细胞的迁移、侵袭和EMT。生物药物治疗。2017;96:1341–1348. doi:10.1016/j.biopha.2017.11.074。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 18Cai H，Yao J，An Y，Chen X，Chen W，Wu D，Luo B，Yang Y，Jiang Y，Sun D，He X.LncRNA HOTAIR通过海绵miR-613在胰腺癌中控制notch3的表达，发挥竞争性内源性RNA的作用。Oncotarget公司。2017;8:32905–32917. doi:10.18632/目标16462。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 19王杰，郭晓杰，丁寅，蒋JX。MiR-1181通过STAT3抑制胰腺癌的侵袭和增殖。世界胃肠病杂志。2017;23:1594–1601. doi:10.3748/wjg.v23.i9.1594。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 20Lin F，Wang X，Jie Z，Hong X，Li X，Wang M，Yu Y.miR-146b-5p靶向MMP16对胰腺癌细胞迁移和侵袭的抑制作用。华中科技大学医学科学杂志。2011;31（509）doi:10.1007/s11596-011-0481-5。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 21何H、郝SJ、姚L、杨F、狄Y、李J、蒋YJ、金C、傅DL。MicroRNA-218通过调节ROBO1抑制胰腺癌的细胞侵袭和迁移。癌症生物治疗。2014;15：1333–1339。doi:10.4161/cbt.29706。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 22Cuccurullo V，Mansi L.AJCC癌症分期手册：摘自AJCC肿瘤分期手册（第7版）Eur J Nucl Med Mol成像。2011;38(408) [谷歌学者] 23Livak KJ，Schmittgen TD.使用实时定量PCR和2（-Delta Delta C（T））方法分析相关基因表达数据。方法。2001;25:402–408. doi:10.1006/meth.2001.1262。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 24Harden VA和Hannaway C：美国国立卫生研究院（NIH）。收录于：生命科学百科全书。纽约，John Wiley&Sons有限公司，2001年。[谷歌学者] 25Schober P，Boer C，Schwarte LA。相关系数：适当的使用和解释。Anesth分析。2018;126:1763–1768. doi:10.1213/ANE.00000000002864。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 26Bray F、Ferlay J、Soerjomataram I、Siegel RL、Torre LA、Jemal A.2018年全球癌症统计：GLOBOCAN对185个国家36种癌症的全球发病率和死亡率的估计。CA癌症临床杂志。2018;68:394–424. doi:10.3322/caac.21492。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 27Xu W，Chang J，Du X，Hou J.Long非编码RNA PCAT-1通过miR-145-5p在前列腺癌中调节FSCN1，从而促进肿瘤发生。生物药物治疗。2017;95:1112–1118. doi:10.1016/j.biopha.2017.09.019。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 28霍X、王H、霍B、王L、杨K、王J、王L和王H。FTX通过靶向miR-335-5p/NUCB2轴促进肺腺癌细胞增殖和迁移。癌细胞国际。2020;20（89）doi:10.1186/s12935-020-1130-5。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 29Sun J，Zhang P，Yin T，ZhangF，Wang W.LncRNA PVT1的上调通过调节MiR-519d-3p和HIF-1A促进胰腺导管腺癌细胞的进展和糖酵解。癌症杂志。2020;11:2572–2579. doi:10.7150/jca.37959。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 30郭X，张勇，刘磊，杨伟，张强。HNF1A-AS1通过调节miR-124/MYO6调节结直肠癌细胞的迁移、侵袭和糖酵解。Onco针对Ther。2020;13:1507–1518. doi:10.2147/OTT。S231249。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 31Li H，Yao G，Zhai J，Hu D，Fan Y.LncRNA FTX通过miR-144/ZFXAxis促进胃癌的增殖和侵袭。Onco针对Ther。2019;12:11701–11713. doi:10.2147/OTT。S220998。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 已缩回 32Feng Y，Gao L，Cui G，Cao Y.LncRNA NEAT1通过稳定ELF3 mRNA促进胰腺癌生长和转移。美国癌症研究杂志。2020;10:237–248. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 33张C、朱斌、李晓波、曹玉强、杨JC、李霞、刘玉霞、王玉波。长非编码RNA SNHG7通过上调SOX4促进黑色素瘤的迁移和侵袭。欧洲药理学评论。2019;23：4828–4834。doi:10.26355/eurrev_201906_18069。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 34王玉华，霍伯伦，李C，马庚，曹伟。敲除长非编码RNA SNHG7通过下调BDNF抑制甲状腺癌细胞的增殖并促进其凋亡。欧洲药理学评论。2019;23:4815–4821. doi:10.26355/eurrev_201906_18067。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 35Xu C，Zhou J，Wang Y，Wang A，Su L，Liu S，Kang X.通过下调长非编码RNA SNHG7抑制恶性人类膀胱癌表型。癌症杂志。2019;10:539–546. doi:10.7150/jca.25507。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 36罗X、宋Y、唐L、孙DH、季DG。LncRNA SNHG7通过调节microRNA-186促进乳腺癌的发展。欧洲药典修订版。2018;22:7788–7797. doi:10.26355/eurrev_201811_16403。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 37Sun X，Huang T，Liu Z，Sun M，Luo S.LncRNA SNHG7通过EMT启动和notch-1通路与miR-34a相互作用，参与乳腺癌的肿瘤发生和进展。欧洲药理学杂志。2019;856（172407）doi:10.1016/j.ejphar.2019.172407。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 38Chen W，Ye L，Wen D，Chen F.MiR-490-5p通过直接调节ROBO1抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。病理性肿瘤研究。2019;25：1–9.数字对象标识代码：10.1007/s12253-017-0305-4。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 
