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Onco针对Ther。2021; 14: 1007–1020.
2021年2月12日在线发布。 数字对象标识：10.2147/OTT。S273823美元
预防性维修识别码：第7886252页
PMID：33603407

基于串联质谱标记的肝癌分化潜在生物标志物蛋白质组分析

王伟（音译）,#1,* 李强,#2,* 葛黄,三 林炳耀,1 东子林,1 阎马,1 赵章,4 陈涛（Tao Chen）,1和周杰（音译）1
作者信息 文章注释 版权和许可证信息 PMC免责声明

摘要

目的

肝细胞癌（HCC）预后不良，迫切需要发现早期有效的生物标志物。在本研究中，我们应用串联质谱标记（TMT）的蛋白质组学分析来发现潜在的用于肝癌鉴别和分化的蛋白质标记物。

患者和方法

15名患者，高分化（G1，N=5）、中分化（G2，N=5）和低分化（G3，N=5），30对匹配组织（肿瘤和相邻非肿瘤组织均来自同一患者）被纳入研究。所有样品均进行TMT标记和LC-MS/MS分析。随后将鉴定的蛋白质分配给GO和KEGG以预测功能。使用免疫组织化学（IHC）对识别的候选蛋白进行验证。

结果

共鉴定出1010个蛋白质。其中，154个差异表达蛋白（DEPs）在肿瘤组织和邻近非肿瘤组织中被发现，其中100个上调，54个下调；在G1和G3组织中发现12个DEPs，其中9个上调，3个下调；G1和G2组织间存在8个DEPs，5个上调，3个下调；在G2和G3组织中发现11个DEPs，8个上调，3个下调。其中，与G1和G2肿瘤相比，G3肿瘤中ASS1和CPS1显著上调，而UROD和HBB显著下调。与G2和G3肿瘤相比，CYB5A、FKBP11和YBX1三种蛋白在G1肿瘤中显著上调。IHC进一步验证了7个候选生物标志物。

结论

已鉴定出多种与肝癌组织分化相关的DEPs，其中ASS1、CPS1、URPD和HBB蛋白是鉴别低分化肝癌的潜在生物标志物，CYB5A、FKBP11和YBX1是鉴别高分化肝癌的可能生物标志物。我们的发现可能进一步为肝癌的诊断和预后提供新的见解。

关键词：串联质谱标签，蛋白质组分析，肝细胞癌，组织学分化，诊断，预后

介绍

肝细胞癌（HCC）是最常见的肝癌类型（占70-90%），也是全球癌症相关死亡的主要原因之一。1晚诊断和有限的治疗方式解释了HCC患者的高死亡率和不良预后，而使用有效的生物标记物进行早期诊断可以提高生存率和治疗选择。甲胎蛋白（AFP）是HCC临床诊断中最常用的生物标志物。2然而，低诊断敏感性和特异性，以及其他非肝脏疾病的干扰，使其作为肝癌生物标志物的临床意义降至最低。2,三

肝癌的发展是一系列基于组织学变化的多基因、多步骤的协同过程。肿瘤细胞最初为高分化（I级，G1），然后发展为高增殖率的中分化（II级，G2）和低分化（III级，G3）类型。4与G1或G2肿瘤患者相比，G3肿瘤患者更容易发生侵袭性和转移性疾病，预后更差。5以前的证据表明，HCC肿瘤的蛋白质组图谱具有等级依赖性。6–9因此，鉴定G1、G2和G3肿瘤中的差异表达蛋白（DEG）对揭示HCC的发展和预后具有重要的临床意义。

蛋白质组学分析越来越多地用于蛋白质表达的全局评估。多种蛋白质组学方法已被应用于研究肝癌的各个方面，例如研究潜在的分子机制，10识别HCC表型的相关蛋白质组特征，11–13筛选用于早期诊断和预测的分子生物标志物，14–16以及检测新的治疗靶点。10然而，目前还没有关于G1、G2和G3肝癌中蛋白质组差异的报道。

新蛋白质组学策略的发展使我们能够进一步探索肝癌分化中的分子事件。串联质量标签（TMT）是一种用于基于MS检测和量化生物分子的化学标签，在使用无凝胶蛋白质组学方法比较生物流体、组织和细胞等各种样品的蛋白质组学中发挥着重要作用。17TMT能够将从不同临床样品制备的所有肽组进行多路复用，并将其组合到单个液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析中，从而通过避免无标签定量中常见的缺失值来提高吞吐量和覆盖率。

在这项研究中，我们试图对与肝癌组织分化相关的蛋白质进行全面的比较分析。基于TMT的定量蛋白质组分析用于探索不同组织学分化程度的HCC组织与其相邻配对非肿瘤组织之间的DEPs谱，以确定肝细胞分化的潜在诊断蛋白生物标记物。使用免疫组织化学（IHC）进一步验证了潜在的候选生物标志物。通过阐明不同HCC分化程度中发生的蛋白质组变化，我们希望为HCC分化提供潜在的诊断和预后蛋白标记物，并为未来研究提供新的治疗靶点。

方法

道德声明

所有实验均经佛山市第四人民医院伦理委员会批准（批准代码：2019012），并符合《赫尔辛基宣言》。本研究的所有参与者均出具了书面知情同意书。

患者选择和标本采集

研究人群包括2017年1月至2017年12月在佛山市第四人民医院组织病理学诊断为肝癌的住院患者。所有肝癌诊断均符合《中国原发性肝癌诊治指南》（2017年版）。18排除以下患者：1）75岁以上；2） 患有神经性厌食症、炎症性肠病、免疫性疾病或内分泌紊乱；3） 感染；4） 伴胆管癌、胃癌或其他肿瘤；5） 出现胃肠道出血或肿瘤破裂出血等严重并发症；6） 在过去4周内接受过任何外科治疗、放射治疗或化疗；7） 服用可能严重影响新陈代谢或体重的药物；8） 都怀孕了。共招募了15名肝癌患者，并根据其组织学分化程度将其分为以下组：高分化组（G1组，N=5）、中分化组（G2组，N=5）和低分化组（G3组，N=5）。登记患者的临床病理数据见补充表S1.

在每个患者中，获得临床HCC组织和相应的相邻非肿瘤组织。样品用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗，以去除血液、污染物和剥离的粘膜，然后在液氮中冷冻，以尽量减少蛋白质降解。每个样品制备三个生物复制品。

蛋白质提取

分别处理从15个肿瘤组织和15对非肿瘤组织中提取的蛋白质。对于每个样品，向冷冻组织中添加100μL RIPA裂解缓冲液（Beyotime Biotechnology，中国北京，目录号P0013C），用组织匀浆器（1998–1，Biovision，San Francisco，USA）将其分解，然后使用高强度超声处理器（VC500，Sonics&Materials，New York，US）在冰上超声六次。离心（12000×g，4°C，20 min）后，收集上清液。然后，使用Pierce™Top 12 Abundant Protein Depletion Spin Columns（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，Cat.No.23227）对样品进行处理，以去除高丰度比的蛋白质。根据制造商的说明，使用Pierce™BCA蛋白质测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，目录号23227）测定消耗后的蛋白质浓度。

蛋白质还原、烷基化和胰蛋白酶消化

在60°C下，将每个样品中约200μg的蛋白质溶液在5 mM二硫苏糖醇中还原1 h，并在室温黑暗中在11 mM碘乙酰胺中烷基化30 min。烷基化后，将蛋白质溶液装入超滤滤液（10 kDa；UFC801096，Millipore，Darmstadt，Germany）中，并在12000×g下离心20分钟。丢弃收集管中的沉淀物。接下来，通过添加100μL尿素缓冲液（8 M尿素，pH 8.5）对样品进行两次洗涤，并在12000×g下离心20分钟，然后用100μL TEAB（0.25M，PH8.5）三次洗涤，在12000 g下离心20min。然后用胰蛋白酶消化蛋白质悬浮液。以1:50（胰蛋白酶：蛋白质）的质量比添加胰蛋白酶（TPCK处理，中国上海桑贡；分类号A003740-0100），用于在37°C下第一次消化过夜，并以1:100（胰蛋白酶-蛋白质）的重量比添加，用于随后在37°C下第二次消化4小时。消化后，为以下实验收集每个样品约100μg的蛋白质。

串联质量标签等压标记

将15个HCC组织和15个相邻的非肿瘤组织混合到8个集合样本中，这些样本被指定为G1、G2、G3、HCC、G1非肿瘤、G2非瘤、G3非肿瘤和HCC非肿瘤。G1、G2、G3及其相应的非肿瘤组的合并样本是通过在每组中混合5个等量的蛋白质生成的，而HCC和HCC非肿瘤组是通过混合所有15个等量蛋白质生成的。胰蛋白酶消化后产生的肽通过Strata-X C18固相萃取（SPE）柱（Phenomenex，Torrance，CA，USA）脱盐，然后真空干燥。随后，按照制造商的说明，在0.5 M TEAB中重组肽，并用TMT10-plex™等压标记试剂盒（3 x 0.8 mg，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司，产品目录号90111）进行标记。样品标记为（G1）-127N，（G2）-128N，（G3）-129N，（HCC）-130N，（G1非肿瘤）-127C，（G2-非肿瘤）128C，（G3-非肿瘤）−129C，（HCC-非癌）-130C。每组产生三个生物复制品。将标记的肽与TMT试剂在室温下孵育2小时，然后合并、脱盐并在真空离心中干燥。

高pH反相分馏

通过配备Acclaim™PepMap™100 C18色谱柱（3µm，100¦Μ，75µm x 15 cm；AB Sciex，分类号4381664）的高pH反相高效液相色谱（HPLC）（8050，日本东京岛津）对标记的肽进行分馏。用溶剂A（0.1%甲酸，2%乙腈）重新溶解混合肽。然后，以0.2 mL/min的流速洗脱样品（100μL），并通过在214 nm处测量吸光度进行监测。梯度从5%增加到37%溶剂B（0.1%甲酸，98%乙腈）75分钟，在5分钟内从37%增加到95%，并在最后5分钟内保持在95%。每隔50秒收集一次馏分。最终获得共12个馏分，并真空干燥，以进行后续LC-MS/MS分析。

LC-MS/MS分析

将分馏后的肽溶解在含有0.1%甲酸和5%乙腈的水溶液中，并加载到Thermo Scientific EASY捕集柱（100 mm×2 cm，5 mm，100º，C18，Thermo Fisher Scientistic）和分析柱（75 mm×25 cm，5 mm100º、C18，therom Fisher科学）上。然后，在EASY-nLC 1000超性能液相色谱（UPLC）上以600 nL/min的流速，以5%至28%溶剂B（0.1%甲酸，98%乙腈）的梯度将肽分离90 min，分离40 min，然后再分离28%–90%溶剂B 2 min，然后分离90%溶剂B 18 min系统（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。液相分离后，将肽进行纳米电喷雾电离，然后在Q Exactive质谱仪（美国马萨诸塞州赛默飞世尔科学公司）在线耦合到HPLC中进行串联质谱（MS/MS）。

数据库搜索

使用Proteome Discoverer 2.2（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科学公司）处理原始数据。搜索参数设置如下：数据库，UniProt-human filtered organic Homo sapiens（human），9606个条目；【分类学，智人】定量方法：TMT 10-plex标记；前体离子质量容限，10 ppm；碎片离子质量容限，0.02Da；酶、胰蛋白酶；最大遗漏劈理，2；固定修饰：半胱氨酸上的氨基甲酰，TMT-10plex（N-项），TMT-10-plex（K）；可变修饰，蛋氨酸氧化；错误发现率（FDR）小于1%。对于TMT定量，使用来自原始数据集的MS/MS光谱中TMT报告离子强度的比值（m/z 127-130）来计算样品之间的倍数变化（丰度比）。对于每个样品，定量在肽水平上平均正常化，以集中定量值的分布。然后将蛋白质定量计算为给定蛋白质对应的独特或剃刀肽的中位数比率。两个可比较组之间折叠变化>1.20或<0.83且未调整显著性水平P值<0.05的蛋白质被视为差异表达蛋白质（DEPs）。

使用WebGestaltR对DEPs进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）功能富集分析(http://www.webgestalt.org/option.php). 提出了p值<0.05的重要GO术语和途径。检索相互作用基因/蛋白质的搜索工具（STRING）10.5版(http://www.webgestalt.org/option.php)应用于DEPs的潜在蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析。获得了置信度≥0.4的所有交互作用，并通过Cytoscape软件可视化了产量PPI结果。

免疫组织化学

肿瘤和邻近的非肿瘤组织在4°C的4%多聚甲醛中固定24小时，第二天清洗并保存在70%乙醇中，直到石蜡包埋。由经验丰富的病理学家对石蜡包埋组织的苏木精-伊红（HE）染色切片（3μm）进行分化等级检查。根据标准的去亲和和包埋免疫组织化学方案，对3μm厚的甲醛固定和石蜡包埋组织进行免疫组织化学分析。将组织切片（3μm）脱蜡，并在75°C的干燥箱中加热25分钟，以揭开抗原位点。在自动模式下使用Ventana BenchMark Ultra（英国罗氏诊断有限公司）和抗体（中国上海Abcam，Cat.ab170952）、CPS1（中国上海Abcam，Cat ab129076）、UROD（加利福尼亚州圣克鲁斯，美国，Cat.sc-365297）、HBB（加利福尼亚州圣克鲁斯，USA，Cat sc-21757）、，CYB5A（Abcam，中国上海，Cat.ab69801）、YBX1（Abcam，中国上海；Cat.ab76149）和FKBP11（Abcam-中国上海，Cat ab237528）。

结果

蛋白质分析

TMT分析显示382274个光谱和7867个匹配查询。在对Uniprot智人数据库进行搜索后，在3426个肽段中共鉴定出1010个独特蛋白质。将蛋白质表达增加1.2倍或减少0.833倍作为生理学显著变化的基准，进一步筛选各组间的DEPs。HCC肿瘤和非肿瘤组织之间共有154个DEP（上调100个；下调54个）(补充表S2)，G1和G1非肿瘤组织之间有30个DEPs（上调18；下调12）(补充表S3)，G2和G2非肿瘤组织之间41个DEPs（上调20；下调21）(补充表S4)G3和G3非肿瘤组织之间的11个DEPs（上调5；下调6）(补充表S5)，已识别。G1组和G2组之间发现11个DEPs（上调8；下调3）(图1A；补充表S6). 在G1组和G3组之间发现12个DEPs（上调9；下调3）(图1B；补充表S7). G2组和G3组之间发现8个DEPs（上调5；下调3）(图1C；补充表S8). 绘制了三组DEPs表达的层次聚类图。热图显示，这些蛋白质被很好地区分，从而改进了整体蛋白质变化的可视化(图1D).

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低分化（G3）、中度（G2）和高分化（G1）肝细胞癌（HCC）差异表达蛋白（DEPs）的火山图和层次聚类。显示DEPs显著褶皱变化分布的火山图(A类)G1和G2(B类)G1和G3，以及(C类)G2和G3肝癌。红点和绿点分别表示显著上调和下调的蛋白质。(D类)代表21个DEP的层次聚类。红色表示上调，绿色表示下调（图旁的颜色条）。

候选蛋白作为肝癌分化生物标志物

如果一个蛋白在G1中的表达与G2和G3肿瘤相比存在差异，则该蛋白被确定为G1肿瘤的潜在标记物。同样，如果与G1和G2肿瘤相比，G3中的蛋白显著上调或下调，则该蛋白可能是G3肿瘤的潜在标记物。应用上述标准，我们进一步筛选了用于识别G1和G3肿瘤的潜在标记物。与G1和G2组织相比，G3组织中精氨酸琥珀酸合成酶（ASS1，P<0.001）和氨甲酰磷酸合成酶[氨]（CPS1，P<0.001）显著上调，而尿卟啉原脱羧酶（UROD，P<0.01）和血红蛋白亚基β（HBB，P<0.001，表明这四种蛋白可能是区分低分化HCC的潜在生物标志物(表1和​和2；2；图2). 与G2和G3组相比，G1组的细胞色素b5（CYB5A，P<0.01）、核酸敏感元件结合蛋白1（片段）（YBX1，P<0.001）和肽基-脯氨酸顺反异构酶FKBP11（FKBP11,P<0.001）显著上调，提示这些蛋白可能是鉴别高分化肝癌的潜在生物标志物(表1和​和2；2；图2).

表2

差异表达蛋白质的统计信息

基因符号G1/G2号机组G1/G3号G2/G3级G1/G1非肿瘤G2/G2非肿瘤G3/G3非肿瘤肝癌/非肿瘤
ASS1系统0.9280.354 **0.381 **0.188**0.436*0.9790.373 **
CPS1系列0.8310.337**0.406 **0.169**0.5860.8000.344 **
城市轨道交通0.8351.739 *2.082 **1.4592.229**0.7781.495 *
乙型肝炎病毒1.4793.722 **2.517 **0.368**0.6320.398**0.616 **
CYB5A基因2.866 *4.257 *1.4850.6790.308*0.4590.383 *
YBX1型1.817 **1.575 *0.8671.10.69*1.3390.805
FKBP11型2.694 *4.085 **1.5162002年9月9日**2.4290.6252.048 *

笔记：*P<0.05**P<0.01。

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肝细胞癌（HCC）肿瘤和非肿瘤组织之间以及分化良好（G1）、中度（G2）和分化较差（G3）的HCC之间差异表达蛋白ASS1、CPS1、UROD、HBB、CYB5A、YBX1和FKBP11的丰度比。与G1和G2组织相比，G3组织中ASS1和CPSI上调，而UROD和HBB下调；与G2和G3组织相比，CYB5A、YBX1和FKBP11在G1组织中上调。

为了进一步验证MS结果，选择了7个已鉴定的候选蛋白进行IHC染色。图3显示了从配对HCC组织中获得的代表性IHC染色模式，与癌旁组织相比，候选蛋白ASS1、CPS1、CYB5A、YBX1和HBB的表达降低，肿瘤中蛋白UROD和FKBP11的表达增加。G1、G2和G3肿瘤的IHC染色结果与MS结果一致，G3肿瘤中ASS1和CPS1蛋白表达较高，UROD和HBB蛋白表达较低；以及蛋白CYB5A、YBX1和FKBP11在G1肿瘤中的高表达(图4).

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肝细胞癌（HCC）和邻近非肿瘤组织之间七种候选蛋白（ASS1、CPS1、UROD、HBB、CYB5A、YBX1和FKBP11）的代表性免疫组织化学染色。比例尺为500μm。

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在高分化（G1）、中分化（G2）和低分化（G3）肝细胞癌（HCC）组织中对七种候选蛋白（ASS1、CPS1、UROD、HBB、CYB5A、YBX1和FKBP11）进行代表性免疫组织化学染色。原始比例尺为500μm。

GO和KEGG路径丰富

使用7个潜在的蛋白质标记物进行GO和KEGG途径富集分析。生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞成分（CC）中最丰富的GO术语分别被注释为代谢过程、催化活性和细胞质(图5).

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7种DEPs（ASS1、CPS1、UROD、HBB、CYB5A、YBX1和FKBP11）的基因本体富集分析可能用于鉴别低分化和高分化肝癌。

KEGG途径分析确定了4条显著富集的途径，包括精氨酸生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、氨基酸生物合成和代谢途径。ASSI和CPS1蛋白都与几个途径有关(表3).

表3

高分化和低分化肝癌差异表达蛋白的KEGG通路富集分析

身份证描述计数财务总监匹配蛋白质
地图00220精氨酸生物合成20ASS1、CPS1
地图00250丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢20ASS1、CPS1
地图01230氨基酸的生物合成20.001ASS1、CPS1
地图01100代谢途径三0.019ASS1、CPS1、UROD

蛋白质-蛋白质相互作用分析

在PPT网络中，蛋白CPS1描述了与蛋白ASS1和YBX1的相互作用，而蛋白ASS1显示了与蛋白CPS1和UROD的交互作用(图6). 其中，只有CPS1和ASS1被发现在功能上具有高度的相关性(表4).

表4

高分化和低分化肝细胞癌差异表达蛋白的蛋白-蛋白相互作用分析

蛋白质1蛋白质2邻里关系基因融合共同表达实验数据库文本挖掘分数
CPS1系列ASS1系统0.1850.6270.5220.350.80.8030.995
CPS1系列YBX1型000.064000.4410.454
ASS1系统城市轨道交通0.14700000.3530.424
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7个DEPs（ASS1、CPS1、UROD、HBB、CYB5A、YBX1和FKBP11）的STRING网络可能用于识别低分化和高分化肝癌。不同的线条颜色代表关联的证据类型。绿色描绘邻里关系；红色：基因融合；粉红色：实验；浅绿色：文本挖掘；蓝色：共现；深蓝色：共同表达；紫色：同源；圆圈节点表示不同的蛋白质。交互网络显示在证据视图中。

讨论

组织分化是影响恶性肿瘤预后的重要因素。低分化HCC肿瘤具有较高的侵袭和转移风险。19肝癌患者预后极差的主要原因是疾病复发或远处转移的高频率。因此，鉴定分化特异性失调蛋白将有助于阐明HCC进展的潜在机制，从而实现早期诊断和预后，并为不同分化程度的HCC提供新的治疗靶点。本研究首次对不同分化程度的HCC组织进行了全面的蛋白质组学筛选，以确定用于区分HCC分化的候选蛋白。借助于基于TMT的蛋白质组分析，我们确定了4种蛋白质（ASS1、CPSI、UROD、HBB）作为鉴别低分化HCC肿瘤的潜在生物标志物，3种蛋白质（CYB5A、YBX1、FKBP11）作为鉴别高分化HCC瘤的潜在生物标记物。这些潜在的生物标记物通过IHC染色得到了进一步确认和验证。

上述结果表明，这7种蛋白及其生物学功能可能直接或间接地与肝癌细胞的恶性行为有关。ASS1和CPS1是尿素循环中的酶。尿素循环是汉斯·克雷布斯于1932年首次发现的。20其主要功能是通过一系列生化反应将蛋白质和氨基酸代谢产生的有毒氨转化为无害的尿素。21尿素循环由五种催化酶组成：两种线粒体酶，即CPS1、对乙酰氨基酚转酰酶（OTC）和三种胞浆酶，即ASS1、精氨琥珀酸裂解酶（ASL）和精氨酸酶（ARG）。ASS1是尿素循环中精氨酸生物合成的速率限制酶。它催化瓜氨酸和天冬氨酸生成精氨琥珀酸，然后将其转化为精氨酸。22ASS1缺失的肿瘤通常具有化疗耐药性，但其生长严重依赖于细胞外精氨酸，即精氨酸营养不良。23HCC表现出ASS1的下调，因此是精氨酸营养不良。24选择性清除细胞外精氨酸已被证明是肝癌的有效抗癌治疗方法。25有证据表明，ASS1蛋白缺乏是转移发展的预测性生物标志物，并与HCC的不良预后有关。26与之前的研究结果一致，本研究结果还表明，与癌旁非肿瘤组织相比，肝癌组织中ASS1的表达显著下调。此外，与G1和G2肿瘤相比，ASS1在G3中过度表达，表明其在鉴别低分化HCC中的潜在作用。

CPS1是一种肝脏特异性的线粒体内酶，是尿素循环中的第一种速率限制酶，负责将氨转化为磷酸氨基酰胺。27CPS1的下调在文献中经常与肝癌相关。一项研究报告称，75%的人肝癌组织表达低水平的CPS1。28一些人甚至报告人类肝癌细胞中不存在CPS1。29,30在本研究中，与邻近的非肿瘤组织相比，CPS1在HCC肿瘤组织中的表达也显著下调。此外，我们进一步指出CPS1的表达随着G3肿瘤的发展而增加。黄曲霉毒素B1（空军基地1)是一种有效的致癌真菌毒素。以前的研究表明AFB1下调CPS1蛋白水平。31Yang等人利用内源性免疫共沉淀结合GC-MS，发现了CPS1的三种相互作用蛋白，包括II型细胞骨架1（KRT1）、白蛋白（ALB）和普遍蛋白C（UBC）。31他们表明，CPS1与KRT1、ALB和AFB相互作用和共定位，负调控1影响了这些相关性的相关强度。据报道，CPS1、ALB和KRT1参与癌细胞的发育和分化。32TMT分析结果显示，ALB的表达呈现上调趋势（0.05<P<0.01），这进一步支持了Yang等人的结果。31总之，CPS1与HCC的发展和分化有关，有可能用于鉴别HCC的分化。

有趣的是，我们的数据表明，随着低分化HCC的进展，ASS1和CPS1在HCC肿瘤中的表达持续增加。这种现象可能是血液转移的结果。血管生成是肿瘤生长、侵袭和转移的基础。一氧化氮（NO）是一种调节不同癌症相关事件的生理信使，包括凋亡、进展、侵袭和转移。33NO由尿素循环提供的L-精氨酸生成。34精氨酸受ASS1和CPS1调节，因此ASS1与CPS1的丢失可能导致NO的减少。这表明肿瘤组织中NO的过度表达会导致肿瘤细胞毒性和凋亡。我们推测HCC肿瘤细胞的形成需要低浓度的NO环境。因此，ASS1和CPS1的表达下调，从而减少NO的生成。在分化不良的时期，需要生成大量的肿瘤血管来进行血液转移，从而上调ASS1与CPS1以促进NO的产生。然而，低分化HCC肿瘤中ASS1和CPS1的表达仍低于非肿瘤细胞，这允许形成微血管，但NO的量不足以产生凋亡，同时也可以清除有毒氨。这是首次报道ASS1和CPS1的表达增加伴随着HCC分化的进展。肝癌分化过程中蛋白质变化的潜在机制仍需进一步研究。

尿卟啉原脱羧酶（UROD）催化尿卟啉元的四个乙酸侧链脱羧形成粪卟啉原。UROD突变或缺乏可引起迟发性皮肤卟啉症（PCT）。证据表明，PCT是肝癌的危险因素。35,36荟萃分析结果显示，PCT患者中约50%的丙型肝炎病毒（HCV）感染率，提示HCV可能在PCT中起生态致病作用。37这些数据表明UROD与HCC有关。与人类蛋白质图谱的数据一致，目前的研究还发现，与非肿瘤组织相比，肝癌组织中UROD过度表达。此外，与G1和G2肿瘤相比，G3肿瘤中UROD表达显著下调，表明UROD在鉴别低分化HCC中的潜在作用。

血红蛋白亚单位β（HBB）是血红蛋白的重要组成部分。本研究结果显示，与邻近的非肿瘤组织相比，肝细胞癌中HBB的表达显著降低，低分化肿瘤中HBB的表达降低。通过2-DE结合ESI-QTOF MS/MS，Khan等人检测到与纤维化肝和HepG2细胞系相比，HCC中HBB的表达显著下调，38这与我们的发现一致。尽管血液样本可能导致假阳性，但体外培养的HepG2细胞系也检测到HBB的表达。38贫血是HCC的常见并发症，地中海贫血患者HCC的发病率也在上升。39铁超载是地中海贫血患者肝癌的危险因素之一。铁的致癌性与诱导氧化损伤（导致遗传毒性）和免疫失调（削弱癌症免疫监测）有关。39血红蛋白是一种重要的携氧蛋白，在建立宿主对病原体的抵抗力和调节先天免疫反应方面发挥着至关重要的作用。40HBB是血红蛋白的重要组成部分，血红蛋白在抗病毒天然免疫中也起着重要作用。Yang等人表明，HBB是RIG-I/MDA5信号通路的多效性调节器，可以直接抑制MDA5与dsRNA的结合，并负调控MDA5介导的IFN的产生；或参与调节细胞氧化应激以增强RIG-I泛素化，从而间接促进RIG-I介导的干扰素的产生。41因此，HBB的低表达可能导致游离铁介导的氧化应激增加，从而促进HCC的发生和发展。这些发现可能有助于更广泛地了解HBB在肝癌分化中的潜力。

细胞色素b5（CYB5A）是一种膜结合的血液蛋白，是几种膜结合氧化酶的电子载体。Lee等人利用2-DE蛋白质组学分析证明，CYB5A的差异表达可以准确区分HCC组织与邻近的非肿瘤组织和正常肝组织。42Khan等人还发现，与纤维化肝和HepG2细胞系相比，肝癌中CYB5A的表达下调。38我们的研究表明，与邻近的非肿瘤组织相比，肝癌组织中CYB5A的表达显著下调，这与上述结果一致。此外，CYB5A在G1肿瘤中的表达显著高于G2和G3肿瘤，这表明CYB5A在HCC的浸润和扩张阶段相对较低。由于CYB5A主要位于内质网，内质网应激（ERS）可能是其原因。ERS是内质网环境扰动后，未折叠或错误折叠蛋白质积累的病理生理反应。伴随HCC发展的一系列应激性细胞条件（缺氧、营养缺乏、能量缺乏、氧化应激等）可能触发ERS。43内质网是一个动态的、专门化的膜网络，牵涉到各种细胞过程，并充当维持细胞内环境稳定的中央协调器。44它在不同分化程度的肿瘤细胞中显示出不同的功能。45因此，CYB5A的表达改变表明，这些蛋白可能被用作HCC的新诊断因子或HCC分化的预后因子。

FK506结合蛋白（FKBP11）是FK506-结合蛋白家族的成员，参与肽基-丙基顺反异构酶（PPIase）的活性，与炎症密切相关。46先前的研究发现FKBP11在HCC发展过程中的表达逐渐升高，这表明FKBP1作为HCC早期生物标志物的潜在作用。47我们的研究结果进一步支持了FKBP11作为早期生物标志物的作用，因为与相邻的非肿瘤组织相比，在HCC组织中观察到FKBP1的过度表达。有研究表明FKBP11与内质网应激和未折叠蛋白反应有关，内质网胁迫途径与肝脏恶性肿瘤和HCC进展有关。46,48因此，FKBP11可能是肝脏损伤事件的早期反应基因，表明内质网应激是由代谢紊乱和病毒感染引起的肝炎引起的，并随着疾病的进展而急剧增加。总之，FKBP11可以作为一种潜在的蛋白质标记物来区分高分化肝癌。

YBX1属于冷休克域家族，是一种高度保守的多功能蛋白。它结合细胞核中的DNA和细胞质中的RNA，参与转录调节、RNA加工和翻译调节，并在各种癌症的肿瘤进展、转移和耐药性中发挥促癌基因作用。49–51在这项研究中，与邻近的非肿瘤组织相比，肝癌组织中YBX1的表达往往较低，而与G2和G3肿瘤相比，G1肿瘤中YBX1的表达明显较高。已经证明，YBX1在肝脏发育和再生过程中上调，此时肝细胞处于未成熟状态，需要旺盛的细胞增殖。52此外，YBX1通过负调控CPS1的表达而成为氨解毒的关键调节因子。53本研究表明，随着低分化HCC的进展，HCC肿瘤中YBX1表达持续下降，CPS1表达持续增加，进一步证实了HCC中YBX1和CPS1之间的负相关。Chao等人证明了YBX1的核定位，尤其是在HCC起始细胞、EpCAM+细胞或球形细胞中。52这些结果表明YBX1是HCC肿瘤发生的关键因素，并且可以维持HCC起始细胞群。52这解释了与G3肿瘤相比，G1肿瘤中YBX1的表达显著上调，因为高分化肿瘤是HCC的初始阶段。总之，YBX1可能是肝癌分化的潜在蛋白标记物。

综上所述，本研究显示了不同分化程度肝癌的DEPs谱。其中，ASS1、CPS1、UROD和HBB具有鉴别低分化肝癌的潜力，而CYB5A、YBX1和FKBP11是鉴别高分化肝癌的候选生物标志物。这些发现为不同分化程度肝癌的早期诊断和预后提供了新的见解，并为进一步研究提供了潜在的治疗靶点。

资金筹措表

本研究得到广州市科技计划（No.2020-02-03-06-303-0015）、佛山市科技创新项目（No.FS0AA-KJ218-1301-0035）、暨南大学第一附属医院培养基金（No.2019315）、，广东省中医药管理局（No.0201078）、广东省医学科学基金（No.B2018014）、广州市科技计划（No.02002030200）。

披露

作者声明在这项工作中没有利益冲突。

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文章来自Onco靶点和治疗由提供鸽子出版社