国际分子医学杂志。2019年3月；43(3): 1430–1440.
重组菌毛蛋白牙龈卟啉单胞菌通过TLR4/NF-κB信号通路诱导人外周血单个核细胞的炎症反应
，1 ，1 ，1 ，2 ，三 ，三 ，1和三
潘亚萍
2中国医科大学口腔学院牙周与口腔生物学系，辽宁沈阳110002
2中国医科大学口腔学院牙周与口腔生物学系，辽宁沈阳110002
2018年9月29日收到；2019年1月15日接受。
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摘要
牙龈卟啉单胞菌是一种牙周病原体，可能与其他微生物一起积聚在龈下菌斑生物膜中，并与牙周疾病相关。牙龈假单胞菌菌毛（fimbriae，FimA）是细菌表面的丝状结构，与细菌对宿主组织的粘附和定植密切相关，在生物膜形成中起着重要作用。本研究旨在构建牙龈假单胞菌FimA原核表达质粒，纯化FimA融合蛋白，并探讨重组FimA蛋白对人外周血单个核细胞（PBMC）炎症反应的影响。牙龈假单胞菌利用基因克隆和重组技术构建了FimA原核表达质粒。用SDS-PAGE对纯化的重组FimA蛋白进行评价。分别通过CCK-8测定和ELISA检测用FimA融合蛋白处理的PBMC的细胞增殖率和炎性细胞因子表达，其中转染或不转染toll样受体4（TLR4）小干扰（si）RNA。通过蛋白质印迹分析和逆转录定量聚合酶链反应检测TLR4、活化B细胞核因子κB轻链增强子（NF-κB）和髓系分化初级反应88（MyD88）在PBMC中的表达水平。获得了一个高纯度的FimA融合蛋白。FimA融合蛋白治疗显著增加PBMC增殖，促进PBMC中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-6、基质金属蛋白酶（MMP）-8和MMP-9的释放。TLR4干扰逆转了FimA融合蛋白对PBMC增殖和炎症细胞因子释放的影响。FimA融合蛋白处理后，PBMC中TLR4、NF-κB和MyD88的表达水平显著增加，而FimA融合蛋白质处理和TLR4干扰后，PBMCs中这些基因在mRNA和蛋白水平的表达水平明显降低。FimA融合蛋白通过TLR4/NF-κB信号通路增加PBMC增殖并促进炎症细胞因子TNF-α、IL-6、MMP-8和MMP-9的释放。FimA可能是一种有前途的牙周病治疗策略。
关键词：牙龈卟啉单胞菌，牙龈假单胞菌菌毛、细胞增殖、炎性细胞因子、toll-like receptor 4/nuclear factor kappa-light-chain enhancer of activated B cells signaling pathway
引言
牙周病是一种慢性炎症性疾病，其中牙周组织被病原微生物感染(1). 慢性牙周病是成年人牙齿缺失的主要原因，其发病率高达85%(2-4). 尽管临床治疗技术越来越成熟，但控制牙周病的发生并了解其发病机制仍然具有挑战性。细菌在寻找治疗牙周病的有效治疗靶点方面发挥着特别重要的作用(5).
牙龈卟啉单胞菌是一种众所周知的牙周病原体，积聚在龈下菌斑生物膜中并侵入牙周组织(6-8). 此外，牙龈假单胞菌可能释放多种毒力因子，包括半胱氨酸蛋白酶、血凝素、脂多糖和牙龈假单胞菌菌毛（FimA）。FimA对组织结构的侵入很重要牙龈假单胞菌FimA是这些细菌表面的丝状结构，与细菌对宿主组织的粘附和定植密切相关，在生物膜形成中起着重要作用(9，10). 主要基因编码牙龈假单胞菌pilin基因座是FimA基因，在牙龈假单胞菌(11，12). 炎症细胞对牙周组织的侵袭和炎症反应是牙周病发生的主要因素(13). 然而，详细的机制牙龈假单胞菌FimA与牙周病发展中的炎症反应密切相关，但尚未完全阐明。
单核/巨噬细胞作为一种重要的外周血单核细胞，在牙周病的发生发展中起着重要作用(14). 当单核/巨噬细胞受到刺激时，免疫反应可能通过分泌细胞因子介导，但过量的细胞因子可能破坏牙周组织并加剧牙周病的进展(15). 细胞因子肿瘤坏死因子（TNF）-α是一种具有广泛生物活性的低分子量蛋白。这种细胞因子在炎症早期大量分泌，是炎症的触发因子(16). 细胞因子白细胞介素（IL）-6是一种促炎因子，在急性期调节蛋白质的产生，诱导和加剧炎症反应，削弱牙周组织修复能力，加速破骨细胞的成熟，导致牙槽骨破坏(17). MMP-8是一种间质胶原酶，MMP-9是一种IV型胶原酶。中性粒细胞分泌的基质金属蛋白酶（MMP）-8和MMP-9可分解胶原蛋白、明胶和弹性蛋白，在牙周组织破坏过程中发挥重要作用(18). 先前的研究表明，FimA可能调节PBMC介导的炎症反应(19).
本研究旨在构建牙龈假单胞菌通过基因克隆和重组技术获得FimA原核表达质粒，以纯化FimA融合蛋白并研究这些蛋白对PBMC中炎性细胞因子的影响，研究其致病机制牙龈假单胞菌进一步发展牙周病的临床治疗。
材料和方法
受试者招募、血液采样和PBMC培养
2017年9月至2017年12月，从锦州医科大学附属第二医院选择12名健康志愿者，他们的牙周健康状况良好（37.5±6.3岁），无已知的牙周袋形成或附着丧失，无牙槽骨吸收，无全身性疾病。其他排除标准包括有牙龈炎、牙周病、正畸治疗或长期使用抗生素或其他药物史。所有参与实验的受试者都由同一位牙医进行牙周检查。受试者明确理解实验目的，同意参与并提供书面知情同意书。标本采集得到了锦州医科大学第二附属医院伦理委员会（中国锦州）的批准。每个志愿者共采集了10 ml静脉血，储存在EDTA抗凝管中（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）。采用Ficoll-Paque密度梯度离心法分离PBMC（650×g；18°C，20分钟），并在添加10%胎牛血清（FBS；Gibco；Thermo Fisher Scientific，Inc.）的RPMI-1640培养基中培养PBMC。所有细胞在含有5%CO的培养箱中生长237°C，100%湿度。
牙龈假单胞菌培养及基因组提取
冷冻（−80°C）的液体培养物牙龈假单胞菌在室温下解冻33277株【美国型培养物采集中心（ATCC），美国弗吉尼亚州马纳萨斯市】，并将其接种在含有脑心灌注（BHI）琼脂的有盖培养皿上，其中含有1 mg/l维生素K、1 g/l酵母提取物和5 mg/l氯化血红素（中国沈阳中国医科大学）。细胞在37°C的厌氧条件下培养4天。在无菌、超净的工作台上用无菌环刮去表面菌落，并接种在BHI液体培养基中。细胞生长约24小时，直到细菌生长达到对数期。然后，在4°C下以4000 x g的浓度离心15分钟后丢弃上清液，以获得细菌，并且牙龈假单胞菌提取基因组DNA。按照制造商的说明，使用Wizard Genomic DNA纯化试剂盒（美国威斯康星州麦迪逊市Promega公司）提取基因组DNA。
靶基因的半定量聚合酶链反应（PCR）扩增
基于牙龈假单胞菌国家生物技术信息中心GenBank数据库中的ATCC 33277 FimA序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/蛋白质/)，使用Premier 5.0软件（Premier Biosoft International，加利福尼亚州帕洛阿尔托市Premier生物软件国际公司）设计引物（正向，5′-ATT AGG ATC CAT GGT GGT ATT GAA GAC CAG C-3′；反向，5′-ATA TCT CGA GCC AAG TAG CAT TCT GAC CGA G-3′），从原始序列中删除终止密码子并添加起始密码子。引物由南京GenScript生物技术公司（中国南京）合成。采用LA-Taq酶（中国大连塔卡拉生物科技有限公司）扩增FimA基因。循环条件包括94°C持续5分钟，然后是25个94°C循环30秒，58°C持续30秒，72°C持续2分钟，最后在72°C延长10分钟。PCR产物在Tris-醋酸盐缓冲液（40 mM Tris醋酸盐，1 mM EDTA；pH，8.0）中通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。用溴化乙锭通过紫外透照对产物进行可视化。
质粒构建
将纯化的PCR产物在16°C下连接到PMD19-T载体上过夜。第二天，10μl连接反应混合物添加到200μl BL21（DE3）活性细胞。将细胞充分混合，置于冰浴中30分钟，在42°C下热冲击1分钟，然后再置于冰浴中2分钟。然后，400μ在室温下添加无抗生素溶原肉汤（LB）液体培养基（Becton，Dickinson and Company，Franklin Lakes，NJ，USA），在3°C下轻轻摇晃细胞60分钟。然后，将混合物添加到含氨苄西林的LB固体培养基板中，并在37°C下培养板过夜。第二天，从培养皿中选择一个单一的白色菌落，接种在含有100 mg/ml氨苄西林的5 ml LB液体培养基中，并在37°C下摇晃培养物直到对数相[光密度（OD）0.6-0.8]。将细胞在4°C下以1000 x g离心3分钟，并丢弃上清液。提取少量质粒DNA，在260nm处通过紫外吸收测定质粒浓度。重组质粒用Xho公司我/巴姆37°C下的H I，通过1%琼脂糖凝胶电泳显示，并用溴化乙锭染色。适量（200μl） 的质粒DNA被送往北京博鳌医学实验室（中国北京）进行测序。重组质粒命名为PMD19-T-FimA。经验证的PMD19-T-FimA质粒和空的PGEX-6P-1质粒用Xho公司我/巴姆H I，并回收目标碎片。回收的产物以7:3的片段与载体比率结扎。将结扎产物与大肠杆菌用于转化的BL21（DE3）活性细胞。根据上述方法对细胞进行质粒小型制备，并通过1%琼脂糖凝胶电泳分析提取的DNA，并用溴化乙锭染色。重组质粒命名为PGEX-6P-FimA。
FimA融合蛋白的表达与纯化
选择含有PGEX-6P-FimA的单个白色细胞集落，接种在含有氨苄西林（100 mg/ml）的30 ml LB培养基中，并在37°C下以180 r/min的恒速摇动培养物。用600 nm的波长监测肉汤的OD，当OD值达到0.6-0.8时，以不同浓度（0、0.1、0.3、0.5、0.7和1 mmol/l）添加异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）以诱导不同时间间隔（4、6、8、12和16 h）的表达。从每个诱导温度（16、20、25、30和37°C）收集总共2 ml培养物，并在4°C下以6000×g离心4 min，然后丢弃上清液。小球于200年重新悬浮μl PBS并在冰浴中进行超声波处理（3次脉冲；5秒；100 W），直到肉汤变清。然后在4°C下在6000×g下离心细胞10分钟。收集上清液和沉淀物，并将其储存在−20°C下。用12%的SDS-PAGE确定诱导的最佳条件，并用0.1%考马斯亮蓝R250（在50%乙醇和10%乙酸中）染色2 h，然后用3%氯化钠脱色后显示蛋白带。根据上述实验结果的比较，在16°C下以1 mmol/l的IPTG浓度在OD（600）为0.74的条件下诱导600 ml培养12 h。在4°C下，以6000×g的浓度离心10 min后，丢弃上清液，将细胞重新悬浮在20 ml PBS中μ将l苯基甲基磺酰基氟化物（1:100稀释）添加到沉淀中，然后在冰浴（3个脉冲；5秒；100 W）中超声处理5-8个循环，直到细菌溶液变清。然后将溶液在4°C、6000×g下离心40 min。丢弃上清液，用20 ml GuMCAC-0洗涤缓冲液（20 mmol/l Na）将沉淀完全溶解三人事军官三·12小时2O、 0.5 mmol/l NaCl，6 mol/l盐酸胍；pH值7.9），并在4°C下过夜。第二天，在4℃、6000×g下离心30 min后，收集含油上清液，倒入超滤离心管中，并在4℃和6000×g条件下再次离心10 min，逐渐用不含咪唑的MCAC-0缓冲液（20 mmol/l Na）替换缓冲液三人事军官三·12小时2O、 0.5 mmol/l氯化钠；pH值7.9）。液体澄清后，将含有目标蛋白的澄清溶液添加到谷胱甘肽S-转移酶（GST）凝胶色谱柱中。溶液以0.3 ml/min的缓慢流速通过色谱柱，然后添加萃取/平衡缓冲液（140 mmol/l NaCl，10 mmol/l Na2高性能操作4和1.8毫摩尔/升K2高性能操作4; pH值7.5）。将带有吸附蛋白质的凝胶彻底清洗，直到洗脱液中不存在蛋白质。最后，使用5-10凝胶体积的洗脱缓冲液进行洗脱（50 mmol/l Tris-HCl，33 mmol/l谷胱甘肽；pH 8.0）。控制流速，收集洗脱液并用0.1%考马斯亮蓝R250（在50%乙醇和10%乙酸中）染色2 h，然后用3%氯化钠脱色后显示蛋白质带。
RNA干扰试验
上海基因制药有限公司（中国上海）合成了靶向toll样受体4（si-TLR4）的小干扰RNA和随机序列的负干扰RNA。TLR4的靶序列为：Sense，5′-GGG CUU AGA ACA ACU AGA ATT-3′；和反义5′-UUC UAG UUG UUC UAA GCC CTT-3′，负siRNA的序列为：Sense，5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′；反义5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3′。所使用的浓度为20nM。使用脂质体转染所有质粒和寡核苷酸®2000（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）。48小时后，收集细胞并进行后续实验。
细胞增殖试验
PBMC（1×10三细胞/孔）接种到96个板中，并用FimA融合蛋白（2、4和6）处理μg/ml）在37°C和5%CO条件下转染或不转染siTLR42持续12、24和48小时。使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8；Dojindo Molecular Technologies，Inc.，Kumamoto，Japan）检测细胞增殖。答10μ将1等分CCK-8溶液添加到处理过的PBMC中，并在37°C下再培养4 h。用PBS洗涤细胞两次，然后在37°C下培养1-4 h。使用96 well平板阅读器测量每个孔450 nm处的吸光度值（Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA）。
酶联免疫吸附试验
PBMC以1×10的密度均匀地播种在6个孔中6细胞/ml，用FimA融合蛋白处理（2、4和6μg/ml）在37°C和5%CO条件下转染或不转染siTLR42收集各组细胞培养液，在4℃下以8000×g离心20 min，去除碎片μl） 使用商业化的TNF-α（分类号PT518）和IL-6（分类号PI330ELISA试剂盒（R&D Systems，Inc.，Minneapolis，MN，USA）符合制造商的说明。在450 nm处测量吸收。通过比较样品与标准溶液的相对吸光度来确定炎性细胞因子的浓度。
逆转录定量PCR（RT-qPCR）
从经FimA融合蛋白处理的PBMC中提取总RNA，使用TRIzol转染或不转染siTLR4®试剂（赛默飞世尔科技公司）。然后使用商业逆转录试剂盒（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）将提取的RNA转录成双链cDNA。用以下引物扩增cDNA：TLR4正向，5′-CCG CTT TCA CTT CCT CTC AC-3′；TLR4反向，5′-CAT CCT GGC ATC CTC AC-3′；活化B细胞核因子κ-轻链增强因子（NF-κB）正向，5′-CTT GCT TAG TTG GTC CTC-3′；NF-κB逆转，5′-ACC CGA AGA GAA ACG A-3′；髓系分化初级反应88（MyD88）正向，5′-AGA TGG ACC TCG GGA G-3′；MyD88反向，5′-ATC AAT CAC GCA CGA TTT-3′；β-肌动蛋白前向，5′-TCC CTG TAT GCC TCT G-3′；β-肌动蛋白逆转，5′-ATG TCA CGC ACG ATT-3′。反应体系含有cDNA模板（1μl） ，底漆（1μl） ，2X SYBR绿色混合物（10μl；上海基因核心生物技术有限公司，中国上海）和无RNase水（8μl） ，总体积为20μl.PCR使用ABI 7500系统平台（Applied Biosystems；Thermo Fischer Scientific，Inc.）进行。第2个-ΔΔCq方法用于计算TLR4、NF-κB和MyD88归一化为β-肌动蛋白的相对基因表达(20). 每个基因重复三次PCR扩增。
蛋白质印迹分析
通过放射免疫沉淀测定法（Beyotime Institute of Biotechnology）从用FimA融合蛋白处理的PBMC中提取总蛋白，其中用或不用siTLR4转染。蛋白质浓度通过BCA蛋白质检测试剂盒（贝尤泰姆生物技术研究所）进行评估。总裂解物（50 mg）通过10%SDS-PAGE（Beyotime生物技术研究所）进行分离，然后在室温下在封闭缓冲液中封闭1 h（类别号P0023B；Beyotime-生物技术研究院）。用一级抗体（兔抗TLR4，稀释度1:500，分类号ab13556；兔抗NF-κB，稀释度：1:500，类别号ab207297；兔抗MyD88，稀释度为1:500，种类号ab2064；兔抗β-肌动蛋白，稀释度1:1000，类别号ab8227；英国剑桥Abcam）培养细胞膜。用TBST冲洗后，添加山羊抗兔辣根过氧化物酶结合二级抗体（稀释1:5000；cat.no.ab6721；Abcam，Cambridge，UK），并在室温下再培养2小时。Image J软件版本1.48（美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）分析相对蛋白带密度。
统计分析
使用SPSS 17.0统计软件（SPPS software，Inc.，Chicago，IL，USA）进行数据分析。数据表示为平均值±标准偏差。所有实验至少重复三次。两组之间的比较采用独立样本t检验进行分析，而多组间的比较采用单向方差分析，然后采用Tukey诚实显著性差异检验。P<0.05被认为表明存在统计学上的显著差异。
结果
FimA基因的PCR扩增、重组质粒的构建和序列鉴定
提取的DNA浓度牙龈假单胞菌ATCC 33277被确定为0.125μ克/μl、 A260/A280nm比值为1.85，表明DNA纯度良好，没有RNase污染(). 对PMD19-T-FimA和PGEX-6P-1质粒进行Xho公司我/巴姆H I双重消化，回收纯化的靶片段并结扎，再次进行双重消化。电泳显示一个预期大小的片段，证明所需质粒已成功构建；该质粒命名为PGEX-6P-FimA().
FimA基因的PCR扩增、重组质粒的构建和序列鉴定。（A） 用LA-Taq酶扩增FimA基因。以提取的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因。电泳检测显示一条明显的带，分子量为1000 bp，与FimA的大小一致（1044 bp）。车道1和车道2为FimA目标路段。（B）Xho公司我/巴姆H I双消化PMD19-T-FimA质粒。通道1和通道2是PMD19-T-FimA质粒。（C）Xho公司我/巴姆H I双消化PGEX-6P-1质粒。通道1和通道2是PGEX-6P-1质粒。（D）Xho公司我/巴姆H I双消化PGEX-6P-FimA质粒。泳道1和2是PGEX-6P-FimA质粒。聚合酶链式反应；FimA、，牙龈卟啉单胞菌菌毛；M、 标记。
FimA融合蛋白的表达、纯化和鉴定
重组质粒PGEX-6P-FimA用于表达大肠杆菌在不同条件下表达后，对细胞进行超声处理，并收集上清液和沉淀物。SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色用于检测该蛋白是否在各种条件下表达，并确定该蛋白的存在形式。结果表明，在16℃时，IPTG的浓度为1 mmol/l；诱导后12h蛋白表达量最高；蛋白质主要以包涵体的形式存在(). 在最佳条件下诱导了大量FimA融合蛋白。收集融合蛋白并在4°C下在变性剂存在下梯度洗脱，然后对包涵体进行梯度复性。清洗蛋白质，洗脱目标蛋白质。考马斯蓝染色和western blot分析检测。获得了高纯度的FimA融合蛋白，在~60kDa处有一条明显的带，这与融合蛋白的预期大小一致().
FimA融合蛋白的表达、纯化和鉴定。（A） 最佳诱导条件是在16°C下诱导12小时。通道1、2、3、4和5代表超声处理后的上清液。通道6、7、8、9、10和11代表超声波作用后的沉淀物；异丙基β-D-1硫代吡喃半乳糖苷的浓度分别为0、0.1、0.3、0.5、0.7和1mmol/l。（B） 洗脱蛋白质。通道1和通道2代表超声波作用后细菌溶液的沉淀和上清液；泳道3、4、5和6表示来自四次洗涤的杂质；通道7是洗脱的FimA融合蛋白。（C） FimA融合蛋白的Western blot分析。通道1包含超声前细菌溶液，通道2代表纯化的FimA融合蛋白。M、 标记；FimA、，牙龈卟啉单胞菌菌毛。
FimA融合蛋白治疗增加PBMC增殖
PBMC用2、4或6μg/ml FimA融合蛋白12、24或48小时。CCK-8在3个时间点检测细胞增殖。结果显示，用6μ12小时时的g/ml FimA融合蛋白()以及4和6μ24小时时的g/ml FimA融合蛋白(). 所有浓度的FimA融合蛋白均导致48小时时PBMC增殖显著增加(). 这些数据表明，FimA融合蛋白可能促进PBMC增殖，并参与牙周病炎症反应的发展。
FimA融合蛋白治疗增加PBMC增殖。用2、4和6处理PBMC后，用细胞计数试剂盒-8检测细胞增殖μg/ml FimA融合蛋白用于（A）12、（B）24和（C）48 h。数据表示为基于至少三个独立实验的平均值±标准偏差；*与对照组相比P<0.05（0μg/ml FimA融合蛋白）。FimA、，牙龈卟啉单胞菌菌毛；外周血单个核细胞。
TLR4干扰逆转FimA融合蛋白对PBMC增殖的影响
为了探讨TLR4对PBMC增殖的影响，用2、4或6μg/ml FimA融合蛋白12、24或48小时，有或无siTLR4转染。转染siTLR4后，PBMC中TLR4的mRNA表达显著降低(). CCK-8结果表明，与对照组相比，用FimA融合蛋白治疗和用siTLR4转染在12或24小时没有显著改变PBMC增殖(). 只有经6μg/ml FimA融合蛋白并在48小时转染siTLR4(). 这些结果表明TLR4干扰抑制FimA融合蛋白对PBMC增殖的诱导。
TLR4干扰逆转FimA融合蛋白对PBMC增殖的影响。（A） 通过逆转录定量聚合酶链反应检测转染或不转染siTLR4的PBMC治疗后TLR4 mRNA的表达水平。用2、4和6处理PBMC后，用细胞计数试剂盒-8检测细胞增殖μg/ml FimA融合蛋白（B）12、（C）24和（D）48小时，并用siTLR4转染。数据表示为基于至少三个独立实验的平均值±标准偏差；*与对照组相比，P<0.05（siRNA-转染阴性）。TLR4，toll样受体4；FimA、，牙龈卟啉单胞菌菌毛；外周血单个核细胞；si，小干扰。
FimA融合蛋白治疗促进PBMC释放炎性细胞因子
为了研究FimA融合蛋白是否促进PBMC中炎症细胞因子的释放，用ELISA检测2、4和6处理细胞后TNF-α、IL-6、MMP-8和MMP-9的表达水平μg/ml FimA融合蛋白用于12、24和48小时。FimA融合蛋白质处理（4和6μg/ml）在12、24和48小时显著增加PBMC中TNF-α的释放，2μg/ml FimA融合蛋白处理显著增加PBMC中TNF-α在24小时和48小时的释放(). 在用不同剂量的FimA融合蛋白处理的PBMC中，上清液中IL-6的浓度在每个时间点都显著增加(). 用6μ12 h、4 h和6 h时的g/ml FimA融合蛋白μ24小时、2小时、4小时和6小时的FimA融合蛋白（g/ml）μ48小时时的g/ml FimA融合蛋白(). 此外，经4和6处理的PBMC在24小时和48小时时MMP-9的浓度显著增加μg/ml FimA融合蛋白(). 这些结果表明，FimA融合蛋白治疗PBMC可促进炎症细胞因子的释放。
FimA融合蛋白治疗促进PBMC中炎症细胞因子的释放。用ELISA法检测2、4和6种药物处理PBMC后（A）TNF-α、（B）IL-6、（C）MMP-8和（D）MMP-9的表达水平μg/ml FimA融合蛋白12、24和48小时。数据表示为基于至少三个独立实验的平均值±标准偏差；*与对照组相比P<0.05（0μg/ml FimA融合蛋白）。FimA、，牙龈卟啉单胞菌菌毛；外周血单个核细胞；TNF-α、肿瘤坏死因子α；白细胞介素；基质金属蛋白酶。
TLR4干扰抑制FimA融合蛋白诱导PBMC中炎症细胞因子的释放
为了进一步研究TLR4在FimA融合蛋白诱导PBMC释放炎性细胞因子中的作用，用FimA融合蛋白质处理PBMC，分别转染和不转染siTLR4处理12、24和48小时。ELISA结果表明TLR4干扰显著降低TNF-α、IL-6、，不同剂量的FimA融合蛋白在每个时间点诱导的MMP-8和MMP-9与单独使用FimA融合蛋白质治疗诱导的MMP-8和MMP-9相比(). 然而，FimA融合蛋白治疗（6μ与对照组相比，siTLR4转染显著增加PBMC各时间点TNF-α、IL-6、MMP-8和MMP-9的释放。这些结果表明TLR4在PBMC的炎症反应中起重要作用。
TLR4干扰抑制PBMC中FimA融合蛋白诱导的炎症细胞因子的释放。用ELISA法检测2、4和6种药物处理PBMC后（A）TNF-α、（B）IL-6、（C）MMP-8和（D）MMP-9的表达水平μg/ml FimA融合蛋白12、24和48小时，并转染siTLR4。数据表示为基于至少三个独立实验的平均值±标准差。*与对照组相比，P<0.05（siRNA-转染阴性）。TLR4，toll样受体4；FimA、，牙龈卟啉单胞菌菌毛；外周血单个核细胞；TNF-α、肿瘤坏死因子α；白细胞介素；基质金属蛋白酶；si，小干扰。
FimA融合蛋白通过TLR4/NF-κB信号通路诱导PBMC炎症反应
TLR4/NF-κB信号通路在炎症反应的调节中起重要作用(21). 为了进一步证实TLR4对FimA融合蛋白诱导PBMC增殖和炎症细胞因子释放的作用，在用4μ经siTLR4转染或不转染的FimA融合蛋白（g/ml）24 h后，Western blot分析表明，经4μ24小时时，与对照组相比，g/ml的FimA融合蛋白显著增加，并且在FimA融合蛋白质结合siTLR4转染治疗后，这些蛋白在细胞中的表达水平显著降低(). 此外，RT-qPCR数据表明，FimA融合蛋白增加了TLR4、NF-κB和MyD88 mRNA的表达水平（4μ并且TLR4干扰逆转了TLR4、NF-κB和MyD88的增加(). 综上所述，这些结果表明，FimA融合蛋白以与调节PBMC中TLR4/NF-κB信号通路相关的方式促进炎症反应。
FimA融合蛋白通过TLR4/NF-κB信号通路在PBMC中诱导炎症反应。（A） 用4μg/ml FimA融合蛋白，转染或不转染siTLR4 24小时。（B）western blot数据的密度分析。（C） 用4μg/ml FimA融合蛋白转染或不转染siTLR4 24 h。根据至少三个独立实验，数据表示为平均值±标准偏差。*与对照组相比，P<0.05（siRNA-转染阴性）。TLR4，toll样受体4；核因子-κB；活化B细胞核因子-κ-轻链增强因子；FimA、，牙龈卟啉单胞菌菌毛；外周血单个核细胞；MyD88，髓系分化初级反应88；核因子-κB p65、核因子-激酶B p65亚单位；si，小干扰。
讨论
牙周病是最常见的由牙菌斑引起的炎症性疾病。牙龈放线杆菌和中间普氏菌是牙周病中最常见的厌氧革兰氏阴性菌。这些细菌可能导致牙周袋的形成，导致结缔组织破坏和牙槽骨吸收(22). 细菌性牙周病疫苗的研制已成为牙周病治疗的辅助手段之一。沙尔马等(23)描述了DNA疫苗的使用牙龈假单胞菌FimA蛋白用于预防牙周病。然而，FimA在牙周疾病进展中的潜在分子机制尚不清楚。
本研究克隆了FimA靶基因，构建了FimA融合蛋白的原核表达质粒。融合蛋白主要以包涵体的形式表达。在16°C时，IPTG浓度为1 mmol/l，在12 h时观察到最大蛋白表达水平。值得注意的是，GST标记的包涵体蛋白需要变性和梯度复性才能与谷胱甘肽很好地结合。在考马斯蓝染色和western blot分析后，原核表达质粒PGEX-6P-FimA表达的重组蛋白在约60kDa处显示出一条特异性带，这与预期的蛋白大小一致。
炎症是组织对病原体感染和细胞损伤的生物反应(24).牙龈假单胞菌表现出相对轻微的炎性细胞浸润和弱的抗原特异性免疫反应，在早期阶段诱导以前限制的龈下斑块高度增殖(25). 细胞因子网络的干扰使宿主易受牙龈假单胞菌包括FimA、脂多糖和各种基因毒素，其中FimA是一种重要的毒力因子，可刺激牙龈组织释放多种炎症介质(26-28). 宿主的固有免疫系统通过激活包括单核/巨噬细胞系统在内的机制来减少炎症。炎症因子水平的增加和基质金属蛋白酶的释放可能导致牙周胶原纤维的不可逆分解，导致牙周骨丢失和组织损伤(29，30). 小川等(31)证明了牙龈假单胞菌FimA特异性抗体表达细胞随着牙周病的发展而增加。在感染后期，细菌释放的FimA可能穿透牙龈组织进入血液循环，这可能有助于全身炎症反应，研究证实牙龈假单胞菌FimA刺激人内皮细胞产生IL-8和单核细胞趋化蛋白1，这些细胞因子与动脉粥样硬化密切相关(32，33).
本研究发现，FimA融合蛋白治疗显著增加PBMC增殖，并促进PBMC释放TNF-α、IL-6、MMP-8和MMP-9。长野等(34)使用浓度为1 mg/ml的FimA刺激小鼠巨噬细胞，巨噬细胞系表现出强烈的激活。科克伦(35)结果表明，与对照组相比，牙周病患者牙周组织中TNF-α和其他细胞因子的表达水平显著升高。与未经治疗的牙周病组相比，在牙周病的一般清洁和牙周清洁治疗后，治疗组的TNF-α和其他细胞因子的表达水平显著降低。池泽一郎等(36)发现慢性牙周病患者和健康受试者龈沟液和血清中的TNF-α水平存在显著差异，并且这种差异随着牙周袋的加深而显著增加。然而，单核/巨噬细胞或其他先天性免疫细胞识别和结合FimA，导致细胞内信号和促炎基因激活的机制尚不清楚。
本研究检测了健康受试者中FimA融合蛋白与TNF-α、IL-6、MMP-8和MMP-9的时间和剂量效应相关性，该研究基于先前的假设(37). 实验结果表明，PBMC分泌的TNF-α、IL-6、MMP-8和MMP-9水平随着融合蛋白浓度的增加和治疗间隔的延长而显著升高。这一结果表明FimA融合蛋白可能刺激PBMC体内增加炎症细胞因子的表达，参与牙周病的发病机制。坟墓等(38)纯化FimA融合蛋白，将该蛋白注入小鼠头皮，并进行核糖核酸酶保护试验。结果证实，纯化的FimA蛋白可显著诱导细胞因子TNF-α和MIP-2的表达(38).
研究表明牙龈假单胞菌FimA可能激活Toll-4，这似乎是宿主识别和身体对牙龈假单胞菌(39，40). 在本研究中，FimA融合蛋白诱导TLR4下游信号分子的表达。为了进一步证实TLR4对FimA融合蛋白诱导PBMC增殖和炎症细胞因子释放的作用，同时用FimA融合蛋白质处理细胞并用siTLR4转染。结果显示，TLR4干扰逆转了FimA融合蛋白对PBMC增殖和炎症细胞因子释放的影响，并且在FimA融合蛋白处理和siTLR4转染后，TLR4、NF-κB和MyD88在PBMC中的表达水平显著降低。结果表明，FimA融合蛋白通过调节PBMC中TLR4/NF-κB信号通路，通过TLR4/NF-κ）B信号通路诱导炎症反应。
总之，作为牙龈假单胞菌，FimA在介导炎症反应中起着重要作用。基于基因克隆技术成功构建了PGEX-6P-FimA原核表达质粒，并通过GST亲和层析纯化了特异性FimA融合蛋白。初步实验表明，FimA融合蛋白可能通过TLR4/NF-κB信号通路激活PBMC并随后上调TNF-α、IL-6、MMP-8和MMP-9的表达水平。FimA可能是一种有前途的牙周病治疗策略。
基金
本研究得到了辽宁省教育厅地方服务项目（批准号：JYTFUDF201756和JYTFUDF201745）和辽宁省临床能力建设项目（批准编号：LNCCC-D30-2015）的支持辽宁省大学生创新创业训练计划（批准号：20181060013）。
数据和材料的可用性
本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从相应作者处获得。
作者的贡献
JCa、JCh、XL和YL对实验的概念和设计做出了贡献。JCa、JCh、HG、YP和YL进行了所有实验，并验证了分析数据。YZ、WZ和XL参与了统计分析，并帮助解释了结果。XL监督了与YL讨论的实验。JCa、XL和YL撰写了手稿。所有作者讨论了最终结果并批准了最终手稿。
道德批准和参与同意
标本采集得到了锦州医科大学第二附属医院伦理委员会（中国锦州）的批准。受试者清楚地理解实验的目的，同意参与并提供书面知情同意书。
工具书类
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