细胞外小泡与血清阳性类风湿关节炎患者的全身炎症相关

摘要

介绍

类风湿性关节炎（RA）是一种全身炎症状态，主要影响关节，也影响其他器官，如皮肤、眼睛、肺和心血管系统¹RA患者分为两组：血清阳性型和血清阴性型。类风湿因子（RF）和抗环瓜氨酸肽（抗CCP）抗体是血清阳性RA患者的特征²与血清阴性RA患者相比，血清阳性RA患者中存在抗CCP抗体与更持久的炎症、更大的侵蚀性关节损伤、更严重的临床表现和更糟糕的预后相关^三RF参与疾病发展的情况尚不清楚；然而，有人认为这种自身抗体增强了抗CCP的病理作用⁴这些自身抗体识别抗原后，形成的免疫复合物可以激活循环和关节中的单核吞噬细胞，促进炎症介质的分泌，如TNF-α、IL-6和IL-1β⁵这些细胞因子是RA全身炎症的生物标志物，有助于该病的免疫病理学，因为它们的阻断与临床改善和缓解相关^6–8.

了解哪些循环因素会导致RA患者的全身炎症，对于找到更有希望的干预和治疗方案至关重要。RA患者的循环和滑液中检测到大量细胞外小泡（EV）^9,10EVs在RA发病机制中的作用已开始阐明；例如，这些囊泡表达自身抗原，如瓜氨酸肽（CP），形成IC，并参与miRNA的传递和成纤维细胞样滑膜细胞的激活¹¹EV有助于细胞间通信，对免疫反应（主要是单核细胞和巨噬细胞）有广泛的影响，并诱导TNF-α、IL-6和IL-1β的产生^11,12.

不同的细胞成分参与炎症的发展，包括中性粒细胞、肥大细胞、T和B淋巴细胞以及单核细胞/巨噬细胞。这些细胞的激活导致产生细胞因子和炎症介质。更具体地说，在RA中发现单核细胞/巨噬细胞被激活^13–15在RA中大量浸润滑膜^16,17，并产生TNF-α¹⁷RA患者的循环EV形成IC（EV-IC）^10,18中性粒细胞诱导白三烯生成在体外这表明这些小泡可能参与炎症过程。我们认为EV可以激活循环中的单核细胞，并有助于RA的全身炎症过程，类似于在其他全身性自身免疫疾病中观察到的情况¹⁹然而，EV对单核细胞的影响以前并未与RA相关。因此，我们评估了血清阳性RA患者的循环EV和单核细胞是否与全身炎症反应有关，并评估了EV和EV-IC在单核吞噬细胞中的直接作用。

结果

血清阳性患者的全身炎症反应以高血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平为特征

在不同的全身炎症过程中，血清细胞因子水平发生了变化。测定血清细胞因子作为RA患者全身炎症状态的指标。如图所示1安培根据疾病活动度评分（DAS）−28对患者进行疾病活动度分类，发现细胞因子浓度变化较大；分类为缓解或低活性的患者血清细胞因子浓度升高或非常低。然而，当患者根据血清阳性进行分类时，抗CCP组⁺射频^+/−和反CCP^你好射频^你好与健康对照组（HCs）相比，（血清阳性）患者的TNF-α、IL-6、IL12p70和IL-1β水平显著升高，但IL-8水平没有升高；反CCP⁻射频⁻（血清阴性）患者没有表现出这种增加（图1安培). 有趣的是，当我们评估其他系统性自身免疫性疾病（SADs）患者的细胞因子水平时，例如系统性红斑狼疮（SLE），我们没有发现与HCs相比，促炎性细胞因子血清浓度存在差异（数据未显示）。这些发现表明，所有SAD患者的血清细胞因子浓度没有增加，可能是血清阳性RA患者的特征（抗CCP⁺射频^+/−和反CCP^你好射频^你好).

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图1

血清阳性RA患者（抗CCP⁺射频^+/−和反CCP^你好射频^你好)与血清阴性患者和HC患者相比，血清细胞因子水平升高。(A类)RA患者血清IL-1β、IL-10、IL-12p70、IL-6、TNF-α和IL-8水平（抗CCP⁻射频⁻，反CCP⁺射频^+/−和反CCP^你好射频^你好)和HC。根据DAS28缓解水平（DAS28）对患者进行分类 ≤ 2.6，绿点）；低活性（DAS28 > 2.6–≤ 3.2，黄色圆点）；中度活动（DAS28 > 3.2–≤ 5.1，橙色圆点）；和高活性（DAS28 > 5.1，红点）。通过Kruskal–Wallis检验和Dunn’s检验对各组进行比较事后的，事后的测试。(B类)PCA对比血清阳性和血清阴性RA和HCs患者的促炎细胞因子（IL-1β、IL-12p70、IL-6和TNF-α）以及CRP、IL-10和DAS28变量。PCA内部的热图（右）显示了组分2中每个变量的权重（促炎细胞因子）。

进行主成分分析（PCA），以确定血清阳性和血清阴性RA和HCs患者的血清细胞因子（IL-1β、IL-12p70、IL-6、TNF-α和IL-10）、C反应蛋白（CRP）和DAS28变量之间的相关性（图1B年). PCA显示了两个成分，解释了65%的变异性，并使两组之间的变量得以分离：一组与包括大多数血清阳性患者的促炎细胞因子相关，另一组与CRP、IL-10、，DAS28与血清阳性/阴性无明显相关性。HCs和反CCP⁻射频⁻两组患者均未根据这些变量进行定义，并保持在一起。利用每个变量的主成分分析得到的特征值，创建了一个热图。热图显示，细胞因子IL-1β、IL-12p70、TNF-α和IL-6对血清阳性患者的定义优于DAS28和CRP（图1B年).

血清阳性RA患者中间单核细胞计数高

循环单核细胞亚群频率的改变²⁰和激活总单核细胞产生促炎细胞因子^13–15已在RA患者中描述。因此，我们评估了单核细胞亚群的数量、频率和表型是否与RA患者的血清阳性相关。在抗CCP中观察到经典单核细胞比例下降^你好射频^你好患者，这并没有反映在绝对计数中（图2A、B). 与HCs相比，血清阳性患者中中间单核细胞的比例和计数均显著升高。此外，非经典单核细胞在抗CCP中的比例和数量均减少^你好射频^你好患者（图2A、B). 对中间单核细胞中与EV识别和单核细胞亚群迁移相关的受体的表达进行评估，因为这些细胞在血清阳性患者中的计数和频率受影响最大。血清阳性患者中HLA-DR和CX3CR1的低表达，抗CCP患者中CD86、CD36、CCR2和CCR5的低表达^你好射频^你好将患者与HCs进行比较（图2摄氏度). 与抗CCP相比，在血清阴性患者的所有单核细胞亚群中发现CD18的低表达^你好射频^你好患者和HC（未显示数据）。

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图2

血清阳性患者中间单核细胞计数高。(A类)每个研究组1名个体的全血中CD45+HLA-DR+细胞上的单核细胞亚群（CD14++CD16-（经典）、CD14++CD16+（中间）和CD14+CD16++（非经典）单核细胞）的代表性CD14和CD16热图。(B类)抗CCP经典、中间和非经典单核细胞的频率（上面板）和绝对计数（下面板）⁻射频⁻，反CCP⁺射频^+/−和反CCP^你好射频^你好RA患者和HC。(C)抗CCP中间单核细胞上HLA-DR、CD86、CD36、CCR2、CX3CR1和CCR5的MFI⁻射频⁻，反CCP⁺射频^+/−，反CCP^你好射频^你好RA患者和HC。通过Kruskal–Wallis检验和Dunn’s检验对各组进行比较事后的，事后的测试。

血清阳性患者的EV是血小板衍生、CPs+和形成IC

最近的报告表明EV在自身免疫性疾病中起着关键作用^21,22因为对单核吞噬细胞和免疫系统其他成分的多效性作用不同²¹所有RA患者的EV计数均升高；然而，只有反CCP⁺射频^+/−与HCs相比，患者表现出显著差异（图第3页). 关于电动汽车规模的分销，反CCP⁻射频⁻和反CCP⁺射频^+/−患者的0.1–1.0µm EV比例显著降低，1–3.0µm和3–6.0µm的EV比例升高（图3A、B). 还研究了EV表型以确定细胞来源。血清阳性患者EV-CD41a+比例升高，抗CCP⁻射频⁻与抗CCP组相比，该组EV-CD105+升高^你好射频^你好患者（图3C公司). 考虑到约50%的EV来自白细胞（EV-CD45+），我们评估了不同的白细胞来源。所有患者组EV-HLA-DR+频率均升高，EV-CD14+频率似乎降低，但差异仅在抗CCP方面具有统计学意义⁺射频^+/−组（图3C公司).

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图3

血清阳性患者和HC的循环EV在数量、细胞来源和表型上不同。等离子电动汽车(A类)反CCP中不同大小的计数（以上）和频率（以下）⁻射频⁻，反CCP⁺射频^+/−和反CCP^你好射频^你好RA患者和HC；(B类)左（上），反CCP FSC-A电动汽车代表点图⁺射频^+/−患者和HC，具有不同大小的太平洋蓝色珠子的强度。右（上图），HC和反CCP电动汽车的代表性显微照片⁺射频^+/−患者（如下）使用STEM。(C)左：来自不同细胞来源的循环EV的频率：血小板（CD41a）、白细胞（CD45）、内皮细胞（CD205）、红细胞（CD235a）和来自抗CCP的其他来源（评估分子的EV阴性）⁻射频⁻，反CCP⁺射频^+/−和反CCP^你好射频^你好RA患者和HC。右：抗CCP中不同白细胞来源循环EV的频率⁻射频⁻，反CCP⁺射频^+/−和反CCP^你好射频^你好RA患者和HC。(D类)循环EVs IgG阳性的频率 + 来自抗CCP的IgM-、IgG-IgM+、IgG+IgM+C1q+、HMGB1+和CP+⁻射频⁻，反CCP⁺射频^+/−和反CCP^你好射频^你好RA患者和HC。通过Kruskal–Wallis试验和Dunn试验对研究组进行比较事后的，事后的测试。(E类)电动汽车的总t-SNE（1 × 10⁵)从每组分析和绘制的五个样本中得出（n = 20). 每个点代表单个EV，颜色表示在EV上分析和计算的每个给定标记的ArchSinh5转换表达值，从蓝色表示低表达到红色表示高表达的所有样本。

除了EV细胞来源外，还评估了参与RA生理病理学的EV成分。EV-IC（IgG + IgM-、IgG-IgM+和IgG + 与HCs患者相比，血清阳性患者的IgM+和EV-CPs+显著升高。反CCP⁺射频^+/−EV-C1q+和EV-High-mobility group box 1（HMGB1）+频率高于其他组；血清阴性患者的EVs与HCs相似（图三维). RA患者EV-IC、EV-CPs+、EV-C1q+和EV-HMGB1+的细胞来源均为白细胞和血小板；然而，血小板是血清阳性患者的主要来源（数据未显示）。为了说明EV中IC含量的变化，随机选择RA和HCs患者每组的5名代表性个体，并进行t分布随机邻域嵌入（t-SNE）分析。正如预期的那样，观察到血清阳性RA患者的水泡具有更高的频率和更广泛的EV-IgM+和EV-IgG分布+ HCs和血清阴性患者（图第三方).

滑液和循环中的EV和单核细胞亚群具有一些共同特征

为了评估血清阳性患者循环中观察到的EV和单核细胞亚群表型是否也能在这些患者的滑液中发现，一种抗CCP的SF⁺射频^+/−和两个反CCP^你好射频^你好对患者进行评估。大约20%的SF浸润细胞对应于单核细胞，令人惊讶的是，70%的这些细胞对应于中间单核细胞（图4A级). 然而，与相同患者的循环细胞相比，SF的中间单核细胞中HLA-DR、CD86、CCR2、CX3CR1、CCR5和CD32的每细胞表达更高，而CD36、CD11b和FcμR的每细胞表现更低（图第4页和数据未显示）。有趣的是，24岁血清阳性RA患者的单核吞噬细胞 h培养物中CD32的表达高于HCs中CD11b、CD36和FcμR的表达（补充图¹–^{S1（第一阶段）}). 然后，患者SF中观察到的吞噬细胞一旦开始组织分化过程，就可以获得这种表型²³.

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图4

血清阳性患者的EV和单核细胞在SF和血液中表现出一些相似的特征。(A类)从左到右；图为SF中抗CCP的单核细胞凝聚体^你好射频^你好病人。CD45+HLA-DR门控单核细胞亚群CD16伪彩色图的代表性CD14和FMO+ 来自抗CCP SF的细胞^你好射频^你好病人。来自三名血清阳性患者的SF中的单核细胞亚群频率。(B类)HC（灰色）血液中中间单核细胞的HLA-DR、CD86、CD36、CCR2、CX3CR1和CCR5的代表性直方图^你好射频^你好患者（红色）和来自同一患者的SF（蓝色）。(C)电动汽车的总t-SNE（1 × 10⁵)对来自血清阳性RA患者的三份SF样本进行分析和绘图。每个点表示单个EV，颜色表示在EV上分析和计算的给定参数的ArcSinh5转换表达式值，从蓝色表示低表达到红色表示高表达。

对于SF的EV以及与循环EV相似的EV，血小板和白细胞是这些囊泡的主要来源；此外，规模较大（FSC-A）和复杂性较大（SSC-A）的EV是SF中主要形成IC的EV；这些EV还含有不同比例的HMGB1、HLA-DR和CP（图4摄氏度).

EV、中间单核细胞和促炎细胞因子可根据血清阳性率对RA患者进行鉴别

为了确定RA患者单核细胞亚群和EV中评估的变量与自身抗体水平和全身炎症相关，对患者和HC样本进行了判别分析。包括23个预测变量，包括中间单核细胞计数和受体（CD16、CD64、CD32、CD86、HLA-DR、CCR2、CCR5、CX3CR1）、三个单核细胞亚群的CD18、细胞因子（IL-6、IL1β和TNF-α），以及IgG、IgM、HMGB1、CP、CD41a和HLA-DR阳性EV的频率。四个研究组通过这些变量进行了显著区分（p<0.05），置信水平为95%。然而，反CCP^你好射频^你好和反CCP⁺射频^+/−患者出现轻微重叠。有趣的是，尽管HCs和反CCP⁻射频⁻分离到同一侧，相互排斥（图5A级)这表明EV和中间单核细胞与血清阳性患者的全身炎症密切相关。

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图5

EV、中间单核细胞和促炎细胞因子的变量可区分RA患者的血清阳性和血清阴性，而EV可诱导吞噬细胞单核激活。(A类)对23个变量进行判别分析，包括中间单核细胞计数和受体MFI（CD16、CD64、CD32、CD86、HLA-DR、CCR2、CCR5、CX3CR1）、三个单核细胞亚群的CD18、血清促炎细胞因子（IL-6、IL1β和TNF-α）以及抗CCP抗体IgG、IgM、HMGB1、CP、CD41a和HLA-DR阳性EV的频率⁻射频⁻（灰色圆圈云），反CCP⁺射频^+/−（蓝色圆圈云）和反中共^你好射频^你好（红圈云）RA患者和HC（黑圈云）。(B类)培养24小时的中间单核细胞（上图）和单核吞噬细胞对EVs和EVs-IC的结合和摄取（左图）（3:1囊泡：细胞比） HCs和血清阳性患者的h。采用Wilcoxon符号秩检验（n = 7). (C)HCs和RA患者单核吞噬细胞培养120天后上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平 h，在存在或不存在EVs和EVs-IC的情况下（囊泡：细胞比3:1）。使用双向方差分析和Bonferroni’s进行组间比较事后的，事后的测试（n = 7).

讨论

多项研究已经确定了几种反映RA全身炎症的循环细胞因子和趋化因子^24,25然而，对造成这种情况的部件知之甚少。我们观察到血清阳性RA患者血清细胞因子IL-1β、IL-12p70、IL-6和TNF-α水平较高；相反，血清阴性和SADs患者的这些细胞因子水平没有升高。血清阳性患者还表现出循环EVs对CD41a、IgG、IgM和CP的高阳性率，以及单核细胞亚群（主要是中间亚群）的计数、频率和受体表达发生改变。这些变化在更接近HCs的血清阴性患者中未观察到。实际上，血清阳性患者的EV-IC比EV更能诱导RA患者和HCs的单核吞噬细胞产生IL-1β、IL-6和TNF-α在体外。在RA患者的中间单核细胞和EV中观察到的任何一种变化都与DAS28评估的疾病活动性无关（图^S2系列和数据未显示）。因此，这些结果和判别分析表明，在RA中，血清阳性患者是那些主要表现为全身炎症的患者，这似乎可以部分解释为EVs对单核吞噬细胞的影响。目前认为血清阳性和血清阴性是两种不同的RA实体，每种RA实体都有其自身的发病机制、病程和涉及的基因²⁶.我们的结果与此假设一致，因为血清阳性患者的疾病更严重，预后更差²⁷，表现出明显的全身炎症。

根据RA患者的血清阳性状态，鉴定不同的循环成分，如细胞因子、EVs和单核细胞亚群。一些研究分析了IL-17、IL-15²⁸和IL-33²⁹抗CCP阳性的细胞因子。其他研究侧重于评估SF中的细胞因子；哥梅斯·普埃尔塔等2013年^三发现抗CCP+患者的细胞因子IL-1β、IL-10、IL-17和CCL20趋化因子水平高于血清阴性患者。然而，尚不清楚这些患者的局部炎症过程和全身炎症过程之间是否存在关联。最近的证据表明，细胞因子在抗瓜氨酸蛋白抗体（ACPA）阳性RA患者中起着重要作用。已经观察到，滑膜ACPA阳性患者的SF中IL-6、IL-17和IL-8水平显著升高，并且IL-8水平与RA患者的中性粒细胞计数和更差的临床表现呈正相关³⁰另一项研究表明，破骨细胞暴露于ACPA后会优先释放IL-8，IL-8介导这些细胞的自分泌活化³¹虽然我们没有发现血清阳性患者与HCs和血清阴性患者的血清IL-8水平存在显著差异，但值得注意的是，我们评估了该细胞因子的血清浓度，而不是SF浓度。因此，IL-8可能参与关节炎症而非全身炎症。此外，值得注意的是，IL-8往往与RA中自身抗体的初始攻击有关，其中这种细胞因子似乎与诱导初始骨吸收有关，与血管翳形成和炎症疼痛相比，它与更高的神经病理性疼痛有关^32,33.

我们的结果表明，循环细胞因子和DAS28之间的弱相关性表明，全身炎症过程并不总是与关节炎症相一致。这表明仅根据DAS28的关节承诺将疾病归类为活动性疾病²不足以确定全身和非关节炎症患者。此外，我们观察到，并非所有DAS28高的患者都表现出高水平的循环炎性细胞因子。这可以用与全身炎症过程无关的关节疼痛的产生来解释，因为关节的感觉神经元可以在没有局部炎症、组织损伤或感染的情况下触发RA疼痛³⁴此外，RA过程中经常会出现不可逆的破坏性关节损伤，即使炎症过程消退后仍会感到疼痛。因此，DAS28是一个客观评分，可能会导致对疾病活动的高估，因为它可能会受到压痛关节计数参数的显著影响。因此，仅在DAS28中对RA患者进行临床评估可能会导致对总疾病活动（关节和全身）的不准确反映。

之前已经表明在体外EV-ICs引起中性粒细胞产生白三烯-B4的显著上调¹⁰; 然而，一些研究表明，单核细胞/巨噬细胞是炎症RA关节中促炎细胞因子和趋化因子的主要来源，包括TNF-α和IL-1β³⁵在这里，我们观察到EV，尤其是RA患者的EV-IC，通过HC和RA患者的单核吞噬细胞诱导IL-6、IL-1β和TNF-α的产生。虽然关节中的炎症过程可能有助于循环细胞因子³⁶我们的数据表明，这些介质的其他循环来源似乎存在于血清阳性患者中；特别是，我们的数据支持EV-IC及其与单核细胞的相互作用可能是导致这种现象的原因。然而，单核细胞是否是循环水平血清阳性患者促炎细胞因子的主要来源仍有待调查。

循环细胞因子和改变的EV能够影响远端组织的功能，包括脂肪、骨骼肌、肝脏和血管内皮^37,38已有研究表明，细胞因子水平的长期升高，无论其大小或原因如何，都会产生一系列致动脉粥样硬化的改变，包括RA患者的胰岛素抵抗、血脂异常、血栓前效应、促氧化应激和内皮功能障碍²⁵定义这些患者全身炎症的能力可以更好地确定治疗的类型和剂量，以防止与血清阳性RA相关的共病和/或避免疾病复发。因此，评估血清细胞因子，以及EV和单核细胞中的一些变量，可能是患者随访的一个有希望的工具。此外，在DAS28定义的缓解状态下识别RA患者的全身炎症，可以为RA的发病机制提供重要的见解，并可用于指导这些患者开始使用疾病修饰药物。

与之前的研究一致^9,10我们发现血小板是RA患者最常见的EV来源；此外，我们的研究表明，这种情况主要发生在血清阳性患者中。此外，这些患者循环中EV-IC+和EV-CP+的频率最高，这表明这些结构是RA患者循环和SF中IC、自身抗原和DAMP的重要来源，正如其他人之前提出的那样^10,18,21,22在缺乏胶原受体糖蛋白（GP）VIa的RA小鼠模型中，血小板耗竭可减轻炎症性关节炎，产生较少的血小板衍生EV体内与对照组小鼠相比，脚踝厚度较小，骨骼和软骨侵蚀较差⁹提示这些血小板衍生的小泡在关节炎的发病机制中具有重要作用。

在抗CCP+RF+/-患者与HCs中，观察到EV-CD14+显著降低。CD14有两种形式；由糖基磷脂酰肌醇尾（mCD14）和可溶性形式（sCD14）固定在膜上的形式³⁹据描述，在炎症条件下，CD14可以从单核细胞膜释放到培养环境中⁴⁰因此，RA血清阳性患者EV中观察到的这种分子的减少频率可能基于上述现象。事实上，据报道，类风湿性关节炎患者的sCD14血液水平升高⁴¹此外，在所有RA患者组中观察到EV-HLA-DR+的频率增加，以及血小板衍生EV的高频率。虽然HLA-DR在健康人的血小板或血小板衍生EV中的表达尚未观察到，但以前在患有自身免疫性疾病（如急性特发性血小板减少性紫癜）的患者的血小板中也有描述⁴²对类似患者的研究表明，血小板衍生EV也有HLA-DR表达⁴³因此，RA患者EV-HLA-DR+的增加可能与EV-CD41a+中HLA-DR+的表达增加有关，也可能与白细胞来源有关。需要进一步的实验来解决RA患者的这些假设。

与我们的结果类似，Nathalie Cloutier等.¹⁰据报道，RA患者的循环和SF EV在大小上高度异质，并且比HC的EV大。然而，根据t-SNE图，RA血清学阳性患者的EV大小增加与IC形成之间没有明显关联。在这方面，值得一提的是，我们没有像之前报告的那样排除EV加总⁴⁴事实上，值得注意的是，RA血清阳性患者的EV计数低于血清阴性患者。虽然我们对这一发现没有明确的解释，但我们认为这些囊泡形成的IC可能会导致这些结构聚集^44–46; IC激活和诱导血小板聚集⁴⁷，并且RA患者血液中相当多的血小板衍生EVs是CD62P+和CD40L+（血小板活化标志物）(维拉尔·维斯加J,等.提交的手稿). 因此，IC是否能以类似血小板的方式促进EV的聚集尚不清楚。需要更多的研究来证实这一假设。此前，已证实RA患者SF中的EV通过抗CCP与瓜氨酸化自身抗原的相互作用形成IC¹⁰。虽然我们没有在这里详细探讨这一点，但我们的结果与此一致，因为t-SNE分析表明，一些EV-CP+也是IgG+和IgM+，主要发生在血清阳性患者中。

与我们的研究相一致，其他研究组已证明RA患者循环中中间单核细胞的增加³⁵有趣的是，我们还发现这种增加主要存在于血清阳性患者的循环和SF中，与HC细胞相比，RA患者的中间单核细胞主要捕获EV-IC。对RA血清阳性患者的其他单核细胞亚群进行了研究。在最近的一项研究中，对两组循环单核细胞进行了评估⁴⁸M1单核细胞被定义为CD14、CD68和CCR2阳性，而M2单核细胞核被定义为CD14、CX3CR1和CD163阳性。作者证明，ACPA阳性RA患者的M1/M2比率较高。此外，M1/M2比率与检测到的分化破骨细胞数量呈正相关在体外RA患者样本中。此外，M1单核细胞在脂多糖刺激下产生的IL-6浓度高于M2单核细胞。然而，由于没有研究M1和M2单核细胞中CD16的表达，因此目前无法将这些数据与我们的结果进行比较。

此前，在RA患者SF中发现的CD16+单核细胞与促炎细胞因子水平升高和关节破坏有关^17,49RA患者的中间单核细胞频率与疾病活动评分呈负相关；然而，在我们的研究中，我们没有发现这种关联（图^S2系列相反，我们发现，在血清阳性患者中，中间单核细胞和EV的改变以及血清IL-6、TNF-α和IL-1β浓度的升高密切相关。事实上，RA血清阳性患者的SF中中间单核细胞表现出比相同患者外周血中观察到的更显著的表型变化。这表明关节中的中间单核细胞比其血液中的对应细胞参与程度更高，这可能与这些细胞到达该位置后的促炎激活或分化有关⁵⁰此外，EVs还诱导单核吞噬细胞分泌IL1β、IL6和TNF-α。以前，有人提出以单核细胞/巨噬细胞为靶点应该是抑制RA炎症和骨侵蚀的有力方法³⁵考虑到所有这些方面，很容易推测单核细胞亚群的抑制，主要是中间亚群的抑制（例如，通过避免它们与EVs的相互作用），可能会改善在血清阳性RA患者中观察到的全身炎症过程。实际上，抗TNF-α（inflixamab、adalimumab、etanercept等）和抗IL-6（tocilizumab、sarilumab、sirukumab等）生物治疗是有效的RA治疗方法^51,52，可能通过靶向循环EV的单核细胞促炎反应而部分有用。鉴于在本研究中，生物治疗是一个排除变量，需要进一步调查以确定抗肿瘤坏死因子-α和抗白介素-6治疗的RA血清阳性患者是否EV和单核细胞改变较少，可能与较少的全身炎症有关。然而，值得一提的是，本研究患者接受的治疗与观察到的EV和单核细胞亚群的变化无关（数据未显示）。

最后，我们的结果部分解释了血清阳性RA患者出现的全身炎症现象，EV和单核细胞亚群似乎在其中起作用。血清阳性患者的特征是中间单核细胞数量增加，EV-ICs+和EV-CPs+以及促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的存在。因此，这些循环成分的测量可能是一种有用的方法，可用于确定RA患者的全身炎症参数，而传统工具（如DAS28）无法对这些参数进行任何评估。

方法

电子辅助材料

致谢

作者贡献

C.B.和D.C.为数据的采集、分析和解释做出了贡献；写了主要的手稿。M.R.和G.V.对数据的分析和解释以及论文的起草做出了贡献。C.M.-V.、A.V.-G.和L.C.对临床数据进行了采集和解释。所有作者都审阅并批准了手稿的最终版本。

数据可用性

在本研究期间生成和/或分析的数据集可根据合理要求从相应作者处获得。

笔记

脚注

工具书类