Rasagiline通过调节Bax/Bcl-2的表达延缓视网膜色素变性小鼠模型的视网膜变性

2.2. 拉萨吉林给药

在水中稀释最终浓度为15μg/g体重（BW）/d的Rasagiline（SML0124，Sigma-Aldrich）。如前所述，在出生后的前14天，通过母乳喂养给幼崽服用药物。¹⁸,¹⁹在这两项研究中，研究表明，拉沙吉林通过乳汁从哺乳期母亲分别转移到母乳喂养的小鼠或大鼠身上，抑制全脑样本中的MAO‐B活性。断奶后，根据Eigeldinger‐Berthou描述的方案，在出生后1个月（P30）内通过饮水方式口服药物¹⁸几乎没有修改。未经处理的rd10小鼠作为对照。在P30处对拉沙吉林治疗和未治疗的rd10小鼠进行评估。

2.3. 光电测试（OT）

使用OptoMetry系统（加拿大大脑力学）评估视力。该设备由四个横向监视器封闭的立方体空间组成，其中投影了一个虚拟三维圆柱体，由沿顺时针或逆时针方向随机移动的白色和灰色垂直带组成的正弦波组成。为了评估视力，使用了以下6种不同的空间频率：0.031、0.061、0.092、0.103、0.194和0.272周期/度（cyc/deg），对比敏感度为100%。对于每个频率，每只动物进行一组20次随机测试（10次顺时针和10次逆时针）。在每一次测试中，将杆的空间频率随机呈现给被评估的小鼠。每只动物的动作都通过与设备软件相连的摄像机进行可视化。视频框中的一个红色星号光标表示该动物的头部。该光标可以可视化头部移动，并用于固定虚拟圆柱体的中心，使其保持恒定距离。当圆柱体的条纹开始旋转（12度/秒）时，鼠标以条纹旋转的相同方向移动头部。当老鼠的头部跟随圆柱体旋转，与恒星光标的固定臂相对时，由条纹刺激产生的跟踪运动被认为是一种积极的反应。当5秒后，没有产生跟踪运动时，认为是负面反应。为了提高测试的敏感性，观察者对治疗组和对照组都是盲的。

2.4. 视网膜电图（ERG）

如Valdes‐Sanchez之前所述，进行了全场ERG²⁰并在ColorDome Ganzfeld（美国马萨诸塞州Diagnosys LCC）录制。简言之，为了评估暗视视力，小鼠整夜黑暗适应，并用氯胺酮/甲苯噻嗪（80/12 mg/kg体重）麻醉。瞳孔扩大，角膜局部麻醉。润滑剂凝胶（1%甲基纤维素）用于桥接电极和角膜之间的间隙。带通滤波器截止频率为0.312‐300 Hz。使用单个白色闪光脉冲（6500 K）进行刺激，刺激强度分为六个步骤，即0.01、0.05、0.2、1、3和10坎德拉（cd）。s/m²。每一步平均有15个反应，刺激间隔为15秒。为了评估明视视力，小鼠接受了10分钟的光适应，背景光照度为30 cd/m².刺激强度为3、5、10、15、20和30 cd.s/m²用于获得明视反应。

2.5. 免疫荧光

动物在P30因颈椎脱位而被安乐死。根据实验结果（左眼用于免疫荧光，右眼用于蛋白质分离和Western blot分析），快速切除眼睛并进行处理。在免疫荧光实验中，左眼被固定在冰冷的4%多聚甲醛磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，在4°C下过夜。然后在室温下将固定眼睛在20%蔗糖-PBS中冷冻8小时，并在4°C下在30%蔗糖-PBS内过夜，以进行冷冻切片。将18μm厚的连续切片安装在五个平行系列中，并进行免疫荧光处理。简单地说，样品在0.2%Triton X100/PBS中清洗，并在室温下在1%牛血清白蛋白/PBS中封闭1小时。在4°C下，用一级抗体（小鼠抗视紫红质，Abcam，ab3267；兔抗视紫光质，Abcam，ab59260；兔抗视蛋白R/G Millipore，AB5405；兔抗Bax，细胞信号转导，#5023；小鼠抗Bcl-2，Abcam100/D5 ab692）孵育过夜。孵育后，将样品在0.2%Triton X100/PBS中清洗3次，并与二级抗体（AlexaFluor）孵育^®抗兔488，分子探针，A21206；AlexaFluor公司^®抗鼠633，分子探针，A21052）在室温下放置1小时。经过3次清洗后，用含有4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（Vector H‐1201）的Vectashield安装介质安装节段。所有分析病例的切片按照相同的方案并行处理，但没有与一级抗体进行孵育步骤，以作为免疫反应特异性的对照（图S1（第一阶段）a‐c）。

2.6. 感光细胞核计数

用苏木精和伊红对未经治疗和拉沙吉林治疗的rd10小鼠的横切面进行染色。从五个平行序列的截面中测定了穿过外核层（ONL）的核数。在距离视神经头±500、±1000和±1500μm的相同位置计数感光细胞核的行数。这包括对棒核和锥核的评估。

2.7. 蛋白质印迹

对右眼进行眼球摘除，通过眼球解剖摘除神经视网膜和视网膜色素上皮。在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的冰冷RIPA缓冲液中提取蛋白质。蛋白质含量通过Bradford分析测定，样品储存在−80°C。在12%变性SDS‐PAGE凝胶中分离20微克每种提取物，将蛋白质转移到PVDF膜（Amersham）中，并使用含有0.1%吐温-20（Sigma‐Aldrich）的Superblock Blocking缓冲液（Thermo Scientific）在室温下封闭1小时。主要抗体（兔抗视紫红质，Abcam，ab59260；兔抗视色素R/G Millipore；兔抗Bcl-2，细胞信号，#3498；鼠抗GAPDH，Abcam，ab9484）在4°C下培养过夜。然后在室温下用HRP偶联二级抗体探测膜1小时，并使用ECL plus（Amersham）化学发光法检测免疫反应带。使用ImageJ软件通过密度分析量化Bcl-2免疫反应带，并使用GAPDH免疫反应带进行归一化。

3.2. Rasagiline治疗延缓感光细胞变性

为了评估雷萨吉林对视网膜的神经保护作用，我们计算了垂直于视网膜色素上皮绘制的六个轴上的感光细胞核数量，并在距视神经三个不同距离（±500、±1000和±1500μm）处投射到视网膜色素上皮上（图三A） 。我们的研究结果表明，用雷沙吉林治疗1个月后，光感受器变性明显延迟，表现为ONL中光感受者细胞核数量增加（图三B、 C）。在距视神经±1500μm处的外周视网膜中，感光细胞核数量的显著差异更为明显（图三). 视网膜的这一区域较少暴露在光线下，这可能会对rd10小鼠的视网膜造成损伤，²³可能正是由于这个原因，在小鼠视网膜的这一区域，雷沙吉林对感光细胞的神经保护作用更为明显。

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图3

未经治疗的rd10（对照组）和经拉沙吉林治疗的rd十小鼠的感光细胞核计数直方图。在视网膜上下部分的相同位置计数感光细胞核的数量：距视神经头（A）±500、±1000和±1500μm。用苏木精和伊红染色的未经治疗（B）和雷沙吉林治疗（C）rd10小鼠的横切面。在用雷沙吉林治疗的动物中ONL公司保存（C）。结果表示为平均值±扫描电镜（N=5个对照组，N=6个拉沙吉林治疗组）。使用双向方法确定显著差异方差分析和未修正的Fisher’sLSD公司测试。各组之间的配对比较以及与视神经头的距离*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.001.GCL公司、神经节细胞层；印度卢比，内核层；ONL公司，外核层；零售物价指数，视网膜色素上皮。比例尺代表50μm

拉沙吉林对rd10小鼠的神经保护作用与Eigeldinger‐Berthou先前发表的结果一致¹⁸显示了ONL在Prph2/rds公司拉沙吉林治疗后的突变小鼠。该研究表明，低剂量雷沙吉林治疗（2μg/g BW/d）可对Prph2/rds公司鼠标。¹⁸在我们的研究中，我们使用了艾格尔丁·伯托测试的中间剂量¹⁸没有表现出毒性作用。我们决定使用更高的剂量（15μg/g BW/d），因为rd10小鼠表现出比Prph2/rds公司被认为是RP缓慢退化模型的小鼠Prph2/rds公司小鼠，光感受器退化在出生后2-3周开始（P14-P21），ONL在9个月大时完全退化。²⁴因此，在艾格尔丁·伯托（Eigeldinger‐Berthou）的研究中^{18 ,}疗程为56天。另一方面，由于rd10表型的严重性，其中视杆感光细胞退化的峰值位于P21‐P25，我们仅在30天内使用较高剂量的雷沙吉林进行了短期治疗。

rasagiline的神经保护作用也通过免疫荧光证实（图4A‐F）和Western blot（图4G、 H）。我们观察到，在用雷萨吉林治疗的rd10小鼠的视网膜中，光感受器特异性标记物视紫红质和视紫红素是保守的（图4D‐F）与未经rd10处理的对照组相比，可检测到较少的视紫红质和视蛋白表达（图4A‐C）。我们观察到免疫荧光和Western blot结果之间存在差异，在未经治疗的rd10小鼠中未检测到视紫红质带（图4G） ，但在免疫荧光中观察到弱信号（图4A） 。为了证实这些结果，我们用与进行Western blot相同的兔抗视紫红质抗体进行了免疫荧光（图S1（第一阶段）d‐g）。正如所料，未经治疗的rd10小鼠未检测到视紫红质信号。

众所周知，在rd10小鼠模型中，锥体光感受器的退化速度比杆慢。在P60，视锥细胞完全退化，在P30，一些视锥感光细胞残留在ONL中。²²由于这些原因，我们在rd10未经治疗的小鼠中观察到一条视蛋白带，该带比治疗组弱（图4H） ●●●●。因此，感光细胞核计数和感光标记物的持续性结果证明，雷萨吉林对rd10小鼠的感光细胞退化具有延缓作用，这是一种比视网膜退化更快的模型Prph2/rds公司值得注意的是，拉沙吉林的保护作用似乎与导致RP的基因突变无关，因为rd10和Prph2/rds公司是两种完全不同的突变小鼠。这可能表明该药物可能是一种潜在的RP泛治疗药物。

这项工作得到了欧洲区域发展基金（ERDF）（CP15/00071）和安达卢西亚卫生理事会共同资助的ISCIII（Miguel Servet‐I，2015）的支持。我们感谢Paloma Domiguez Giménez和Cindy Cruz Zambrano提供的技术援助。